ABBE衍射屏障，其基本上将横向光学分辨率限制为200-300nm，直到20世纪900年代初，可以通过超级分辨率光学荧光成像技术克服。这些技术被认为是如此开拓，即2014年诺贝尔化学奖的化学奖被授予Eric Betzig，Stefan Hell和W.E. Mo. Monerer，“用于发展超级分辨荧光显微镜。”
背景
两种常用的技术包括点扩散函数工程和基于单分子定位的技术。
Stefan Hell的受激发射耗尽(STED)显微镜是一流的，据说是一种确定性超分辨率技术。相比之下，Eric Betzig的光活化定位显微镜(PALM)是一种随机技术。
SMLM如何工作?
一切的基本原则SMLM实现是通过在总位置和邻近发射器的总发射的特定位置和时间的特定位置和时间识别它们的光子发射来实现单独的荧光发射器的随机性光激活和随后定位。
衍射受限光子分布的质心可以确定发射体的位置，比光子分布本身更明确。因此，传统的宽视场图像是由大量发射体的光子分布组成的，而超分辨率SMLM图像是它们各自位置的地图，横向分辨率可达5纳米。
具有GEM 473（蓝色）和宝石561（石灰）的光束路径的SMLM的激光舱的照片。图像学分：G. U. Nienhaus和A. Kobitski（套件）
但问题依然存在，如何才能确保在特定时间只发射少量荧光团，从而使单个定位成为可能?PALM中使用的方法利用了绿色荧光蛋白(GFP)家族的光激活荧光蛋白(paFPs)中自发形成的荧光团的某些特性，我们可以解决这个问题。
这些GFP样蛋白的主要益处是它们是遗传编码，使得赋予该基因的细胞产生这些标记物本身，不需要额外的染色程序。通常，选择405nm处的弱化激光，在整个摄像机框架中选择从绿色到红荧光发射器的几个PAPF。通常，可以用561nm激光激发红色荧光。在每个相机框架期间，红色发射出现为红颜色通道中的隔离量的有限量，衍射限制的斑点。
SMLM图像的选择细胞与红转换蛋白;插图显示了细胞核周围的特写。SMLM图像是由1000个连续的相机帧在561 nm的光照下进行荧光激发和另外405 nm的光照下进行蛋白质的绿色到红色的光转换而获得的。黑穗病菌SPF27同源物Num1的细胞质运输机制，科学。众议员8 (2018)3611
光漂白快速消除了红色转换的paFPs，所以新的发射器可以被触发和识别在获取下一个相机帧。谨慎地修改实验参数(摄像机、激光功率、停留时间)，可以降低在单个摄像机帧内检测到两个强度分布空间重叠的荧光团的概率至几乎为零。
所有波长的一个供应商
与共聚焦显微镜相反，宽视场成像技术需要连续的高强度照明更广泛的区域。一个至关重要的方面SMLM激光器是否以适当的波长(通常为405、473、561和640 nm)发射，以激发(可能光激活)用于显示的荧光分子。
激光量子宝石激光系列有4个最流行的波长(473,532,561和640 nm)。
500mW范围内的高激光功率对于PAFP的荧光激发是有利的。来自激光量子的Gem激光器提供了在紧凑，经济高效的平台上具有几乎完美的光束质量的不同波长（473,532,561,640,660,671nm）的电源。高功率还能使最先进的光束成形技术引起的，由于实际功率不是与二极管激光器的限制因子。
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