扩展显微镜：如何以及何时使用它

由和或科技有限公司2020年11月6日

由于光的衍射，传统的光学显微镜有明显的局限性，因此，它不能分辨距离小于200纳米的特征。

显微镜技术开发历史上专注于成像技术的改进，促进单个分子的分辨率。21的初^圣世纪见证了超分辨率显微镜的发展，使成像的分辨率超过了200纳米的限制。^7、8

然而，不幸的是，即使是超分辨率技术也有局限性，包括有限的成像深度、有限的视场、不兼容多色实验、高能照明强度要求和缓慢的采集时间。

为了解决这些问题，一些有创意的研究小组转向了不同的方向，探索直接的、标准化的纳米级成像方法。这项工作的一个结果是扩张显微镜一种成像协议，使传统光学显微镜能够分辨密集排列或亚衍射限制(<200 nm)的细节，这在以前是无法区分的。

麻省理工学院的爱德华·博伊登(Edward Boyden)的团队在2015年报告了这种新的放大方式的发展。该系统是在研究小组试图克服在大脑中大规模神经回路中绘制分子图谱的挑战时开发出来的;博伊登的研究小组成功地开发了一种放大标本本身的方法，而不是放大标本发出的信号。²

表格1。术语表。

术语表:
AcX	丙烯酰x, SE, 6 -(丙烯酰氨基hexanoïc)酯琥珀酰亚胺lique(一种与蛋白质的胺反应并在聚丙烯酰胺基体中共聚的交联剂)
DiExM	不均匀膨胀显微镜
DMAA	N,N二甲基丙烯酰胺酸(非离子丙烯酸单体，可制成可膨胀的聚合物颗粒)欧洲杯猜球平台
ex鱼	膨胀显微镜荧光原位杂交
exm.	扩张显微镜
《外交政策》	荧光蛋白
遗传算法	Flutharaldehyde（交联固定剂，穿透膜比PFA更慢）
HCR	杂交的连锁反应
iExM	迭代扩张显微镜
如果	immunofluorophore
嘛 NHS.	甲基丙烯酸n -羟基琥珀酰亚胺酯(与蛋白质的胺反应并可在聚丙烯酰胺基体中共聚的交联剂)
地图	蛋白质组的最大分析
MBAA 或ba.	N N亚甲基双(丙烯酰胺)/(双丙烯酰胺)交联剂，与丙烯酰胺聚合并在聚丙烯酰胺凝胶内产生交联
PFA	多聚甲醛(交联固定剂，保存蛋白质的二级/三级结构)
ProExM	蛋白质保留膨胀显微镜
SDS	十二烷基硫酸钠(有助于蛋白质变性和解离的阴离子表面活性剂)
SRRF	超分辨率径向波动

HeLa细胞未膨胀微管(右)和4.5倍线性膨胀微管(左)共聚焦图像。“src=

图1所示。HeLa细胞未膨胀微管(右)和4.5倍线性膨胀微管(左)共聚焦图像。在具有40×，数值孔径（NA）1.15水浸物镜的andor纺丝盘共聚焦显微镜（蜻蜓）上进行成像。(一)HeLa细胞的共聚焦图像与免疫染色的微管在细胞底部的单个XY平面上成像。左上角的插图放大了中间右侧的小盒子。(B)~4.5×线性扩展HeLa细胞的共聚焦图像，在细胞底部的单个XY平面上成像免疫染色的微管。左上角的插图放大左下方的小盒子。（b）中的秤条表示后扩展尺度。只有一部分扩展细胞填充整个视野。相应的插入显示完整视野的相应小盒子的缩放。（Zhang，C.等，神经科学的当前方案，2020）。欧洲杯线上买球图片信用：Andor Technology Ltd.

EXM具有高度成本效益，并且该样品制备方法包括在感兴趣的生物学标本内合成可溶胀聚合物的致密互连网。聚合物基质内的组织可以膨胀并标记，然后当浸入水中时，这种膨胀在各向同性地拉开细胞结构，在每种生物分子之间形成大的间隙。

样品是各向同性放大的，这意味着用标准显微镜可以获得有效的更高分辨率。在纯水中有4倍的线性膨胀，意味着64倍的体积膨胀。在扩展微管Hela细胞样本上使用Andor旋转圆盘共聚焦(Dragonfly)(图1)说明了如何使用扩展显微镜协议来揭示样品中之前未见过的特征。

然而，在制备扩展样品时需要格外小心，成功地实施扩展显微镜协议依赖于以下几点考虑:

安全地嵌入 - 必须使用非侵入性方法将聚合物插入细胞中。这是通过小心地将小单体仔细地插入细胞和组织中来实现 - 这些单体是将扩展的水凝胶的构建块，因此必须仅在保存的细胞和组织内完全触发单体聚合。

不破坏结构的扩展-样品必须在保持细胞结构组织的同时进行扩展。为了确保试样在膨胀过程中不变形，试样被加热/洗涤剂或酶消化，以机械均质试样，确保组织保持完整。

表2。扩展显微镜协议的比较。参阅上面的缩略语。

协议名称	exm. (Boyden实验室)	ExM(沃恩实验室)	ProExM （Boyden. 实验室)	地图 (钟实验室)	ExFiSH (Boyden实验室)
水凝胶	丙烯酰胺+丙烯酸钠++ MBAA	丙烯酰胺+丙烯酸钠+++	丙烯酰胺+丙烯酸钠+++	丙烯酰胺++丙烯酸钠+ BA	丙烯酰胺丙烯酸钠MBAA
链接代理	ascrydite.	MA-NHS GA	acryloyle-X (AcX)	丙烯酰胺丙烯酰胺	LabelX（ACX +标签 - IT胺）
破坏代理人	蛋白酶K.	蛋白酶K.	蛋白酶K.	SDS	蛋白酶K.
破坏类型	消化	消化	消化或温柔的破坏	变性解离	消化
膨胀系数(线性)	4．5	4.0 - -4.2	4	4	3．3
解析度	70海里	65 nm.	70海里	60 nm.	/
FP保存	不	是的	是的(50%强度)	不	不
如果染色	不	是的	是的	是的	不
样本	脑组织细胞,	脑组织细胞,	细胞，脑，胰腺，肺，脾组织	细胞，大脑，脊髓，肺，心脏，肝，肾，肠组织	脑组织细胞,
目标	蛋白质	蛋白质和DNA	蛋白质	蛋白质和糖类	RNA与DNA
售价点评	报告的第一种方法	常规荧光团细胞器水平	传统的荧光团膨胀后标记	扩增后标记全器官水平多路染色	扩展后的3D成像FISH复用和HCR放大
意见评价	复杂的协议没有标准的荧光团	膨胀前只标记荧光损失	不完全均匀化荧光损失	不相容 w / fps. 准备失去后 3天	/
参考	Chen et al.， 2015 欧洲杯线上买球Science	Chozonski等人，2016年《自然方法》	蒂尔伯格等人，2016年《自然生物技术》	Ku et al.， 2016 Nature Biotch	陈等人，2016年自然方法
变体	iExM	x10	x10;DiExM	uExM

预扩增显微镜的原理“src=

图2。预膨胀显微镜的原理。1)细胞固定2)对样品进行免疫染色标记，生物分子共价固定在凝胶上3)凝胶化过程中，样品浸泡在单体溶液中，形成化学网络。4)均质过程中，通过酶解将试样结构切碎，确保组织完整。5)水浸入时，发生自发膨胀。在纯水中有4倍线性膨胀(64体积膨胀)的报道。图片来源:和或科技有限公司

有两种主要的方法扩张显微镜：

在扩大组织前对生物分子进行染色(图2)
在染色生物分子之前膨胀组织（图3）

图2和图3显示了细胞和组织可以扩展到4x的协议。光的200纳米衍射极限决定了用光学显微镜可以分辨出什么是分开的，而实现的线性膨胀是4的倍数。当使用这些协议时，在光学显微镜下可以看到分离到50纳米的生物分子。

膨胀后显微镜的原理“src=

图3。膨胀后显微镜的原理1)细胞固定2)内源性蛋白的共价锚定凝胶3)水凝胶包埋高聚丙烯酰胺浓度4)非交联蛋白变性和解离5)水浸泡膨胀6)膨胀后免疫染色可进行多轮。图片来源:和或科技有限公司

膨胀显微镜的基本步骤

荧光信号也通过扩展的各向同性扩展，导致有效的更高分辨率。下面以及图2和图3概述了扩展显微镜协议的关键步骤。

标记-荧光团被用来标记生物分子，尽管在膨胀后标记中，这一步将在膨胀后的最后完成。
锚定-生物分子和/或标签被共价地用分子把手固定，这些交联剂将使聚合物基质对生物分子施加作用力。
凝胶-在这里，聚合物链被分解成它的组成部分，或构建块，以避免对细胞造成损害。然后将试件浸入单体溶液(丙烯酸钠)和渗透水凝胶(聚丙烯酸钠)中。一旦溶液和氢进入细胞内，就会触发化学反应，导致单体结合并形成所需聚合物的网络。
均匀化-这一步的目的是避免样品失真，并确保样品组织得到保持。样品会因酶解或加热和洗涤处理(变性/解离)而被化学破坏。所用的均质处理将取决于样品的性质和要观察的特定分子。
膨胀 - 样品浸入水中，水通过渗透力扩散到聚电解质水凝胶中，促进聚合物膨胀。膨胀将以各向同性的方式拆除锚定生物分子，在各个生物分子之间产生大量间隙。膨胀的标本的空间组织被保留，因此允许使用标准荧光显微镜的纳米级成像。

扩展有丝分细胞的图像“src=

图4。扩大的有丝分裂细胞图像。细胞分裂的最大投影图像，染色为微管蛋白(绿色)和DNA(蓝色)。使用扩展后协议标记的细胞，并用Andor Dragonfly成像。图片来源:样本由Joshua C Vaughan(华盛顿大学)提供。

最流行的扩展显微镜协议

自最初开发以来，已经发布了许多不同的扩展显微镜协议，目前有各种变化和改进，涵盖了广泛的应用。下表总结了扩展显微镜的关键协议。

总结;两种主要策略扩张显微镜同时存在:扩张前和扩张后标记策略(图2和图3)。这些不同的协议适用于特定的细胞结构，所以当开始使用扩张显微镜成像时，必须谨慎选择最合适的协议来可视化所涉及的亚细胞结构。

为了更好地适应实验条件，可能有必要优化方案，并且建议研究人员设计适当的实验控制，以证明要分析的结构的各向同性膨胀。

参考资料及进一步阅读

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张，C.，Kang，J.S.，Asano，S. M.，Gao，R.，＆Boyden，E. S。（2020）“初学者扩展显微镜：可视化展开培养的HeLa细胞中的微管．” Current Protocols in Neuroscience