GLOQUBE®PLUS -利用辉光放电系统制备TEM网格

透射电子显微镜（TEM）是一种高分辨率成像方法，提供有关样本形态和结构的信息。为了渗透样品，它利用高能电子束并使用光束的透射部分呈现图像。

由于高度加速的电子波长小，它们可以用来分辨微小的特征。这种能力在纳米技术、结构生物学和材料科学研究中至关重要。欧洲杯线上买球

要成像的样品必须放置在一个特殊的金属网格上，该网格通常被超薄(2-5纳米)聚合物或碳载体覆盖。它必须首先进行辉光放电过程，以确保表面支持是适合使用的。

图1所示。空气辉光放电碳透射电镜载体上的天然铁蛋白。图片来信：Paul Simpson，帝国学院，伦敦。

为什么我们需要发出放电TEM网格？

如图2所示，即使是刚准备好的碳层TEM网格表面会有多余的吸附物，如水和低分子量材料(LMWM)，通常从空气中吸附。在使用网格之前，必须使用辉光放电去除这些污染物。这样做是为了确保最佳的样品附着力。

图2。典型的透射电镜网格与碳膜和表面吸附物的表征。图片信用：Quorum Technologies Ltd

在TEM网格上沉积的碳层具有可变电荷表面，通常是疏水的，因此即使是水基样品悬浮液的扩散也是极具挑战性的，如图3所示。

图3。对放置在亲水和疏水表面的亲水和疏水粒子的润湿效应。欧洲杯猜球平台图片信用：Quorum Technologies Ltd

什么是辉光放电?

辉光放电等离子体是部分电离的低压气体。它由净正面和负电荷的离子组成。通过有能量电子的存在维持该准中性状态。

当与气体分子非弹性碰撞时，这些电子电离或激发它们，导致气体分子的自由基和离子的形成。在这个过程中所看到的特征辉光是由于被中和的自由基(即电子的弛豫)释放出来的光子。

辉光放电处理是一种已知的方法，用于清洁和修改表面。辉光放电处理的结果与选择的等离子体气体和极性有关。

图4。辉光放电空气等离子体过程。图片信用：Quorum Technologies Ltd

为什么需要不同类型的辉光放电?

生物样品是最难以制备的材料，因为该过程由许多同样重要的步骤组成。欧洲杯足球竞彩失败的一步可​​能会完全丢失样品。

分子与透射电镜支持物的亲和性可能不同，因为它们特定的局部电荷，这在蛋白质中尤其明显，因为分子的特定部分电荷不同。

充分制备的TEM支架增加了保留分子的数量，使样品均匀扩散，并允许分子在TEM支架上定向，以显示他们感兴趣的方面。在环境透射电镜条件下观察生物分子也涉及到用重金属染色的样品。

尚未用辉光放电处理的TEM支撑将导致染色不均匀，导致图像中的对比度差。这种效果也存在于Cryo-TEM中，其中图像可以是不稳定的。

为什么确保TEM网格是均匀的亲水/疏水和所需电荷是至关重要的原因有很多:样品在网格上的准确放置，浸入冷冻(在低温透射电镜中)，或染色和干燥(在环境透射电镜中)，以及成像。网格表面的制备和修饰方法由待成像的分子决定。

图5。（a）碳支撑TEM栅格在发光之前，用液滴放电，液滴显示其疏水性（b）辉光放电处理过的TEM网格，其水滴显示其亲水性（c），（d）相应的接触角。图片信用：Quorum Technologies Ltd

通过应用选择辉光放电方法

所需的辉光放电效果是使TEM碳碳的表面适当地修改并充分充电。薄液膜，其中样品被悬浮在整个表面上均匀蔓延并在整个表面上干燥。下表显示了可能的表面修改的示例与其应用。

资料来源：Quorum Technologies Ltd

应用	大气	表面类型	负责	优点
TEM网格	空气	亲水	[]	网格方界没有粒子​​的聚集欧洲杯猜球平台
TEM网格 跳 云母	空气	亲水性（随后用乙酸镁处理或0.1％w / v波状物）	[+]	更好地将核酸与栅格表面结合
应用	大气	表面类型	负责	优点
TEM网格（用于带正电荷的蛋白质）	碳氢化合物 （例如甲醇）	疏水	[]	与栅格表面的共价结合用于带正电荷的分子
透射电镜栅格(用于蛋白质、抗体和核酸)	烷基胺 (例如Pentylamine)	疏水	[+]	共价结合到网格表面带负电荷的分子上

两个腔室系统的优点

一个紧凑的双腔系统提供了一种快速、有效的方法来试验不同类型的表面修饰。如果最常见的空气辉光放电不能产生令人满意的结果，这是理想的。

图片信用：Quorum Technologies Ltd

当需要化学蒸汽辉光放电时，单室系统不如双室系统容易或可靠使用。这是因为在处理过程中沉积的化学污染物，必须通过清洗腔室和空气中等离子体处理系统来完全清除。

分开使用时，GloQube^®加系统通过使用两个腔室防止交叉污染，并提供无仪器停机。专门设计的吹扫泵循环消除了系统中使用的所有剩余蒸气化学品。

GloQube的表演^®另外，在一系列甲醇蒸汽试验中展示。这些通过利用附着在背衬管线上的隐藏的200amu RGA来进行，监测残留气体。测试表现出没有污染的存在_3.O.⁺离子。污染试验的详细结果可以在技术数据中观察到。

图1所示。甲醇(CH_3.哦）RGA开裂模式。监控的气体：CH_3.在15 amu, CH_3.O在31 amu, CH_3.哦，哦₂32 amu, CHO 29 amu。图片信用：Quorum Technologies Ltd

图2。1.甲醇引入1x10^－1用肺部阀门拆下曼巴和甲醇胶囊。恢复时间4分钟2。甲醇引入1x10^－1Mbar 3分钟，打开排气阀，取出甲醇。恢复时间4分钟3.甲醇引入1x10^－1Mbar 1分钟，甲醇闭合，闭合阀门。恢复时间2分钟。图片信用：Quorum Technologies Ltd

CH._3.o是最敏感的气体监测，质量为31 amu。图2显示，如果从输入到Gloqube中取出甲醇^®加上注入系统，蒸汽从针阀和排放阀总成中泵出大约需要4分钟。当排气阀关闭时，需要两分钟才能把气体抽出腔室。

图3。血浆与甲醇在蒸汽室中运行30分钟。房间里通风良好，两间屋子的门都打开了。清洁室被泵下，当1.5 × 10^－1mbar在洁净室实现，RGA打开。当清洁室继续泵入时，残留气体被监测。在这个过程开始时，所有强度都有轻微的下降，这是由于真空水平的变化，也由于RGA操作压力的调整。压力初始校准后，监测峰值没有变化。当在蒸汽室中使用甲醇时，没有证据表明从蒸汽室污染到洁净室。气体引入后，用泵将甲醇从蒸汽室中抽走大约需要两分钟。图片信用：Quorum Technologies Ltd

辉光放电:空气中的效果

辉光放电空气等离子体用于水解和清洁表面。在整个过程中，来自空气中的氧气被电离成阴性和正离子，进一步反应形成簇。

这些高度活性的物种通过轰击表面和去除吸附物(LMWMs)，使该区域极端氧化和均匀负电荷(大多数具有羧酸和酮基)。由于空气中的氧气浓度低，该工艺对表面没有破坏，使其易于修改。

大多数宏观分子是亲水的，因此它们不喜欢保留在疏水表面上。这产生了在其表面上施加之前的碳膜支撑件的空气辉光放电处理的要求，如图6和7所示。

图6。非辉光排出的碳载体TEM网格对天然铁蛋白样品溶液保持，扩散和染色质量的影响。低(6 x10^－4μg / mL)和高(6 x10^－2μg/mL)。图片信用：Quorum Technologies Ltd

图7。空气辉光放电碳支持透射电镜栅格对天然铁蛋白样品溶液的保留、扩散和染色质量的影响。低(6 x10^－4μg/ ml）和高（6×10^－2μg/mL)。图片信用：Quorum Technologies Ltd

天然铁蛋白具有亲水的3倍通道，铁离子通过这些通道转移到核心。当使用在低浓度，它不保留在非辉光放电碳表面。

高浓度时可以观察到团聚体的形成。碳载体上的不均匀电荷也扰乱了适当的染色，导致蛋白质组之间出现光斑。使用空气辉光放电改变碳表面使表面带负电荷和亲水性，因此自然铁蛋白的保留相当容易。另外，用醋酸铀酰对样品进行负染色，染色均匀，可以正确观察蛋白质分子。

气相辉光放电的方法及过程自动化的优点

手动气体介绍

最早之一TEM样品制备技术利用手动将蒸汽引入到辉光放电室[1]中。使用该技术，玻璃管填充有几毫升化学品，流入辉光放电室的流动由手动铁氟龙阀控制。这将在介绍时，该沉积在TEM网格的表面上，并点燃辉光放电。

滤纸/羊毛

将在化学物质中饱和的一片棉絮或滤纸放入辉光放电室是另一种著名的制备样品分散TEM栅格的方法。一旦化学气体被引入，辉光放电被点燃，化学物质就沉积在透射电子显微镜网格的表面。

毛细管阀门

使用附在腔室进口喷嘴上的毛细管阀是另一种常用的将化学引入辉光放电的技术。然后，阿米胺的瓶子可以连接到毛细管阀，并手动控制蒸汽的流量。［2］

图8。由印迹纸法改性TEM网格碳载体，用于20S蛋白酶体样品应用。闪光放电系统使用：Quorum的Emitech K100x。缺点 - 腔室中的氧气和水蒸气的遗迹扰乱了正确的表面改性，因此网格上仅出现几侧视图。图片信用：Quorum Technologies Ltd

图9。GloQube^®加上自动化阀门系统，连续三次运行显示20s人蛋白酶体蛋白复合物的侧视图产量超过80%。图片信用：Quorum Technologies Ltd

使用化学蒸气发光

通过在辉光放电过程中引入化学蒸汽来实现所需官能团的接枝。这不仅提供了改变表面的润湿性能和电荷的方法，而且还可以允许复合标本与网格表面共价键合。

对于像蛋白质和核酸这样的生物分子，这种制备方法尤其重要。在药物发现和癌症研究领域，了解蛋白质结构及其与其他大分子的相互作用是最大的兴趣。

高分辨率电子显微镜必须用来收集蛋白质结构分析和建模所需的信息。揭示它们的活性亚基是正确和成功收集数据的关键，蛋白质分子在TEM支持网格上的取向在这一过程中起着关键作用。

蛋白质的结构和空间定位通常需要先进的方法来指导它们在TEM支撑网格上的吸附。

使用烷基胺发光

已知烷基胺在发光放电过程中的碳表面上形成带正电荷的疏水薄膜。这些薄膜对蛋白质的带电区域产生负面吸收，从而能够观察所需的定向。

随着蛋白质芯通常也是疏水的，它们所得到的疏水性也有助于在表面上保留分子。20S蛋白酶体蛋白质复合物是用于识别和降解错误折叠蛋白质的已知系统。

这是细胞基本调节机制中癌症治疗的良好目标。淀粉胺（烷基胺基的同源物）用于影响20S蛋白酶体吸附到TEM网格上的取向。

碳载体透射电镜网格在GloQube中改变^®另外，利用戊胺蒸气辉光放电过程，以获得疏水和正电荷表面，以保留20s蛋白酶体复合物的侧面。

图10显示了改变碳载体膜的表面电荷对蛋白质复合物的取向的影响。首先，新鲜制备的碳表面是非均匀的带电和疏水的;因此，可以观察到一些侧视图。

图10。20s人蛋白酶体复合物的TEM图像显示了改变碳支持膜表面电荷对蛋白质分子方向的影响。2.5 nm厚度的碳膜在Quantifoil 1.2/1.3 400目上作为样品的支撑。图片信用：Quorum Technologies Ltd

使用酒精的辉光放电

醇，例如甲醇蒸气引入辉光放电系统将使碳载体栅格略微疏水和带负电。诸如此化的表面将吸引正离子，例如天然铁蛋白。

所有的铁蛋白分子都由24个相同的肽亚基组成，它们折叠成一个球状的壳，里面有一个充满水的空腔。这个空洞通过三重和四重对称的通道与外部连接，被认为是为铁离子和质子提供渗透通道，这对铁蛋白作为铁库的正常功能至关重要。

铁蛋白的载脂蛋白形式(铁蛋白的空壳)也被用作离子笼，用于模板合成纳米颗粒- ZnSe或CdSe。欧洲杯猜球平台铁蛋白笼负荷的成像在检查铁和其他金属摄取方面起着关键作用。

碳支持透射电镜栅格的甲醇蒸汽辉光放电处理将有助于铁蛋白负载的研究，它也将阻止离子通过通道的损失。图11显示，TEM栅极支撑体在空气中辉光放电处理使铁离子从核中丢失，导致空铁蛋白(分子核内的发光区域)。

图11。马脾脏铁蛋白复合物(Sigma Aldrich)的TEM图像(Tencai F20 G2)应用于空气和甲醇蒸汽辉光放电碳支持的TEM栅格。图片来源:伦敦帝国理工学院。

由于表面的负电荷和疏水性，使用网格的甲醇蒸气处理允许使用者将离子保持在芯内（铁蛋白分子内的暗负载）。

概括

这GloQube^®+当需要使用空气或蒸气的这些网格的发光放电时，提供TEM网格准备所需的所有功能。用于空中和蒸汽辉光放电的单独室的利用对于消除交叉污染的风险至关重要。

的GloQube^®Plus设计确保没有交叉污染发生，同时也允许用户运行过程中使用相同的化学品，而无需清洗之间的要求。

由于可以更精确地控制流量和腔室压力，拥有一个自动化的化学注入系统也是一个巨大的好处。这也提供了运行更长过程时间的能力，而不会有耗尽戊胺的风险，因为只使用固定数量的戊胺——例如，不同于滤纸技术。

有一个连续的流动，直到瓶子用自动阀门流出。视觉指示显示了残留在小瓶中的化学物质的水平。自动阀提供的额外控制确保了TEM网格处理的重复性和再现性。

具有隔膜密封小瓶和自动阀门系统的封闭的蒸汽输送系统还会最大限度地减少了经营者暴露于化学品，增加了化学用途的安全性。

图片信用：Quorum Technologies Ltd

参考

[1] Dubochet，Jacques等。“生物致摩托型暗场电子显微镜的新制备方法。”超微结构研究杂志35.1-2（1971）：147-167。

[2]莫里斯，E. p ;;DA Fonseca，P.C.A。药物发育中的高分辨率冷冻蛋白蛋白酶体结构。ACTA CRYSTALOGR D STRUCT BIOL 2017,73（PT 6），522-533。

[3] Aebi，Ueli和Thomas D. Pollard。“焕发放电单元，以使电子显微镜网格和其他表面亲水”。电子显微镜技术杂志7.1（1987）：29-33。

致谢

由Quorum Techno欧洲杯足球竞彩logies有限公司的Anna E Walkiewicz博士的材料制成

此信息已由Quorum Technologies Ltd提供的材料获取、审查和改编。欧洲杯足球竞彩

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