四环素类抗生素是动物生产部门最常用的抗生素之一。它们被用来避免动物感染，治疗疾病和保护动物生长。
动物起源食品（例如，牛奶和肉）的过度抗生素可能导致残留违规，导致消费者健康导致风险。四环素食品中的残留物可能导致一系列问题，包括：
-
对细菌的抵抗力，这可能会转移到人类身上
-
毒性的风险
-
副作用
-
过敏反应
为了减少风险和保障消费者健康，世界各地的监管当局制定了食品中兽药可接受水平的指导方针。在美国，这些水平被称为“耐受性”，而中国、加拿大和欧盟将其称为“最大残留水平”(MRLs)。1,2
利用高度敏感和选择性的技术，以便根据规定的监管要求提供准确监测四环素水平，这是保护消费者健康的关键因素。
本文概述了UHPLC / MS / MS方法，提供了在肉类产品中进行四环素的定量分析所需的速度和灵敏度。
为了提高测试实验室的效率，我们使用了QS-Works高通量自动进样器，原因如下:
-
它的容量很大
-
它具有温度控制的托盘
-
它利用机器人武器，允许长期无人参与使用
-
它允许在一个序列中分析多达600个样本
概述的方法显示出优异的敏感性，恢复，精度，线性度和选择性所需，以分析全球各种监管机构所列出的低容差水平的肉类产品中的四环素。
本实验
使用一系列硬件来进行分析。在PerkinElmer QSight上进行色谱分离®LX50 UHPLC系统。使用a完成检测过程PerkinElmer QSight.®420 ms / ms检测器。
使用高容量的QS工作自动进样器以增加实验室的生产力。使用简单的3Q™软件平台进行数据采集和处理以及所有仪器控制。
LC方法和MS源条件
MS源参数和LC方法见表1。四环素的多反应监测模式（MRM）转换见表2。
表1。LC方法和MS源参数。资料来源：PerkinElmer食品安全和质量
| LC和MS条件 |
| 移动阶段A. |
水（含有0.1％的草酸） |
| 移动阶段B. |
乙腈（含有0.1％甲酸） |
| 纵队 |
PerkinElmer类星体SPP农药，100 × 4.6 mm;2.7 μm， (N9306880) mm |
| 柱温箱温度 |
20°C. |
| Autosampler温度 |
20°C. |
| 注射体积 |
5μL |
| ESI电压（正） |
5100伏 |
| 干燥气体 |
120. |
| 雾化器气体 |
250. |
| 源温度 |
350°C |
| HSID温度 |
250°C. |
表2。MRM转换。资料来源：PerkinElmer食品安全和质量
| 复合名称 |
前体离子/Da |
产品离子/ Da |
行政长官 |
EV / V. |
CCL2 / V. |
| 鼻霉素 |
461.3 |
426.3
201.2 |
-21
-49 |
31.
25. |
-136年
-180 |
| 四环素 |
445.3 |
410.3
427.3. |
-22
-15年 |
29.
27. |
-144
-124年 |
| Chlortetracycline. |
479.2 |
154.0
444.2 |
-34
-25 |
26.
29. |
-136年
-164 |
| doxytetracycline. |
445.3 |
154.1
154.0 |
-35
-34 |
29.
26. |
-140
-136年 |
每个分析物至少监测两次MRM转换。这是为了降低所述方法中的假阳性和假阴性数量。
通过输注标准来完成MS / MS参数的优化，包括父子离子和产品离子，入射电压（EV / CCL2）和碰撞能量（CE）。
通过LC流动对标准品进行t灌注，实现源条件的优化，并在此基础上建立采集质谱法。
标准及样品制备
所有试剂，溶剂和使用的稀释剂都是LC / MS等级。所有四环素标准的标准都来自Sigma-Aldrich®公司。这些被储存在- 20°C的冰箱中，以防止它们的降解。
用于所有四环素的尖峰和校准程序中使用的所有库存和混合药物溶液在甲醇中制备。为了减少标准退化的风险，所有工作和股票标准将储存在冰箱中直至需要。
用于该程序的均质化样品如下：
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将肉的代表性样品切成小块然后混合。
-
1克均匀化的肉样品和8毫升0.1 M EDTA水溶液放置在50毫升离心管中并涡旋。
-
随后将17ml的乙腈置于同一管中并进行旋涡。
-
将离心管放入冷冻柜中，冷冻柜在-20°C下保持30分钟。
-
然后试管在4000转/分的转速下离心10分钟。
-
将8mL的上清液量转移到50ml清洁离心管中。
-
加入5mL己烷的己烷溶液以脱脂样品。
-
将管子旋转3分钟。
-
然后将溶液以4000转/分的转速离心一分钟。
-
将3ml较低相转移到新的15ml离心管中。
-
然后在50℃的温度下吹出氮气将其蒸发至干。
-
通过将干浸膏溶解在1ml甲醇：水（30:70，v/v）溶液中（该溶液含有0.01M草酸）来重组干浸膏。
-
样品萃取物在注入LC/MS/MS系统之前，通过0.2µm PTFE注射器过滤器进行旋涡和过滤。3.
结果和讨论
本文旨在评估高容量QS-Works自动进样器的性能，具有验证的样品制备程序，用于测定肉类样品中的四环素。
利用高吞吐量自动进样器，例如QS工作，增加测试实验室生产力和效率。
QS-Works允许食物测试实验室具有大量样品来更快地处理样品，同时为其机器人采样单元提供增强的数据质量和一致性（图1）。
图1。QS工作自动取样器。图片来源：PerkinElmer食品安全与质量
参考目标水平是利用加拿大卫生部制定的食品中四环素的最大残留水平(MRLs)或美国FDA的耐受量(表3中的X)确定的。
表3。保留时间，矩阵效应（ME），线性，恢复和再现性（％RSD）。资料来源：PerkinElmer食品安全和质量
| 复合名称 |
水平（ng / g）容差（x） |
RT（分钟） |
我（％） |
线性度（R.2） |
恢复(%) |
RSD具有草酸（％）（n = 5） |
没有草酸的RSD（％）（n = 5） |
| 鼻霉素 |
200 |
3.09 |
86 |
0.9984. |
70.0 |
4．6 |
11 |
| 四环素 |
200 |
3.26 |
80 |
0.9997 |
116.0 |
4.9 |
16.0 |
| Chlortetracycline. |
200 |
3.65 |
96 |
0.9991 |
87.3 |
1.9 |
9.5 |
| doxytetracycline. |
200 |
3.73 |
94 |
0.9980. |
71.6 |
1.5 |
8 |
检测阈值或“是/否”筛选级别，应在0.5倍以下。四个四环素的色谱图（XIC）显示出良好的峰分辨率（图2）。
图2。a)土霉素，b)四环素，c)金霉素，d)强力霉素。图片来源:PerkinElmer食品安全和质量公司
观察到两种离子转变以进行确认和鉴定目的，导致鉴定方面的选择性更大和特异性。通过计算峰面积以获得更强烈的离子的峰面积来确定每个离子比以产生离子比率。
LC / MS / MS方法开发的主要问题是样本矩阵效应（MES）。尤其如同分析食物，因为食物样本矩阵的复杂和多样性。
在存在电荷竞争的基质成分的分析物中，ESI很容易受到电离抑制。基质诱导的增强效应可能会在ESI中出现，这可能会导致定量的较大偏差。
对于Surmount样本矩阵效应，已经使用了许多方法，包括：
-
标准之外
-
样品清理
-
利用同位素内标
-
样品稀释
-
矩阵匹配（mm）校准
-
采用高效色谱柱进行改进分离
通过比较从肉类样品基质获得的校准曲线斜率与仅从试剂（RO）获得的斜率，计算样品基质效应。
然后通过比较斜坡之间的百分比差异来确定每个分析物的样品基质效应（表示为百分比）。
大多数化合物的基质效应小于20%（表3）。
本分析采用基质匹配校准对所有分析物进行定量。这是为了控制矩阵效应和减少分析结果的变化水平。
使用纯试剂(RO)和基质匹配(MM)标准进行校准。
由反渗透系数和肉类样品矩阵构建的每一条校准曲线都显示出良好的线性关系(R2）大于0.99。有关校准曲线的典型示例，请参见图3和4。
图3。仅从试剂中制备的标准品中获得四环素的校准曲线。图片来源:PerkinElmer食品安全和质量公司
图4。肉类样品基质中四环素标准品的标定曲线。图片来源:PerkinElmer食品安全和质量公司
通过在高浓度标准后注入试剂坯料来评估携带程度。任何测试中都没有注意到。
将草酸加入到水性流动相中3.防止四环素类化合物被LC部分或柱体的金属离子螯合。这也有助于在运行过程中保持良好的峰值形状和重现性。
该方法显示出良好的精度，RSD为小于5％的RSD，对于五个重复。为了在流动相中使用草酸和重组溶剂对再现性的影响，见表3。
通过将草酸添加到流动相和重构溶剂中，改善了所有分析物的再现性和峰形。分析的每个四环素的定量限制（LOQ）低于肉样品中允许的耐受性水平。
这表明该技术满足分析肉类中四环素耐受水平所需的灵敏度水平。
根据10的信噪比（S/N）估计四环素类药物的LOQ。研究药物的每个LOQ为1.5±1.0µg/L。
这些结果表明该方法可以用于肉类样品中的四环素的快速筛选和定量，而四环素的绝对回收率在70-120％的范围内（表3）。使用氘化四环素的利用可以补偿与该提取过程的四环素的损失。
结论
Perkinlemer高通量QS工作自动进样器和LX 50 UHPLC连接到QSight 420毫秒/毫秒系统用于证明UHPLC / MS / MS程序。
该仪器显示了良好的灵敏度，以确定和定量的四环素均质肉样品。该方法的低检测水平可以帮助支持日常筛选和定量分析的低监管限制。
工具书类
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食品中兽药最大残留限量(MRLs)清单，加拿大卫生部，2017年8月。https://www.canada.ca/en/health-canada/services/drugs-health-products/veterinary-drugs/maximum-residue-limits-mrls/list-maximum-residue-limits-mrls-veterinary-drugs-foods。2020年11月10日。
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标准方法性能要求®)进行食物中受管制兽药残余的甄别及识别方法。SMPR2018_010.pdf (aoac.org)。2020年11月10日。
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Aurélien Desmarchelier、Sébastien Anizan、Mai Minh Tien、Marie-Claude Savoy和Cindy Bion（2018年）基于低温分配液-液萃取的液-液萃取法测定五种四环素及其差向异构体，食品添加剂和污染物：a部分，35:4687-695，DOI:10.1080/19440049.2018.1427894
致谢
由Saba Hariri，A欧洲杯足球竞彩bir Khaled，Avinash Dalmia和Perkinelmer，Inc。的材料制作的材料制作
本信息来源、审查和改编自Perkinlemer食品安全和质量部提供的材料。欧洲杯足球竞彩
有关此来源的更多信息，请访问PerkinElmer食品安全和质量。