质/ MS方法的优化对牛奶和鸡蛋过敏原检测

食物过敏是一个日益增长的健康问题,因为他们在全球变得越来越普遍。¹

应对这种增长,欧盟委员会(EC)发行监管1169/2011。²它规定了一个清单14过敏成分需要显示在相关食品标签时故意纳入食品。³

美国通过了食品过敏原标识和消费者保护法案2004 (FALCPA),概述了八个主要过敏食物的行为,称为“八大国”。⁴澳大利亚和加拿大每个调节12过敏食物,而中国调节11和日本7。⁵

而故意增加过敏成分在食品存在提高不同的特点,也有交叉污染的风险。

这是一个潜在的风险在各种食品加工的食品连锁店,和食品部门没有制定严格的风险评估策略。⁶

目前,立法不解决意外的过敏原引起的交叉污染。保护消费者的健康,许多国家已经建立了自己的行动水平数过敏原。

例如,澳大利亚的过敏原局提出了自愿附带跟踪过敏原标签(至关重要的)计划。这协助食品过敏原的风险评估过程通过设置参考剂量不同过敏原,包括牛奶,鸡蛋,花生,坚果和大豆。⁷

保护消费者过敏反应有意或无意的高污染风险的食品过敏原,一系列的敏感分析方法检测过敏原的食品已经发展了很长时间。

这些方法可以分为两个主要的类:

• 目标特征蛋白质的过敏成分的方法
• 方法利用一个标志或DNA序列表明食品的存在导致过敏

第一节课最一般分析方法,包括酶联免疫吸附试验(ELISA)。这些利用特定抗体的特异性过敏原蛋白的检测。

尽管这些测试可能提供高程度的敏感性和特异性,它们是非常依赖于抗体识别的抗原表位。

抗原表位与其他物种可以受大的影响,然而。食品矩阵的某些成分可能会妨碍吸收测量在ELISA进行测试。

第二个类的分析方法是建立在特定DNA序列编码的放大和检测过敏性蛋白质或种特异的DNA标记的PCR。

虽然DNA是一个非常稳定的分子,烹饪、烘焙或烧烤的食物(热处理)可以导致DNA提取率降低和DNA完整性被破坏。

高度加工食品,例如,卵磷脂、明胶、植物油、淀粉、包含没有DNA。这可能导致他们的挑战进行PCR检测。

近年来,质谱(MS)的方法越来越被视为可靠的多目标方法识别过敏原。质谱促进过敏原的识别污染物与高度的确定通过检测特定的肽和原型签名。

几种方法已经发展在过去的几十年里,利用液相色谱(LC)耦合到各种质量分析器。这些标记肽的发现和使用高分辨率系统三重四极质谱仪进行量化。⁸

MS-based的同步和验证方法能够检测过敏原的范围只有一个运行特性最近欧洲项目的主要目标之一。⁹

因此,本文概述了利用QSight目标方法的性能^®220年液相色谱三重四极质谱仪(质/ MS)。

本文着眼于并发量化的鸡蛋和牛奶过敏原存在于一个热加工烘焙产品,饼干。

内部验证结果将概述,采用AOAC公认的方法性能要求食物过敏原的检测和量化,符合目前提出重要的阈值。

这个实验

标准和试剂

开发的方法是集中在利用本地合成肽。鸡蛋和牛奶都进行了广泛的调查,过敏原,有一个建立共识的审查和最可靠的肽标记的识别。⁹

选择自定义标记肽序列形成的由GenScript和分布式的双胞胎螺旋(表1)。

表1。优化MRM和compound-dependent参数肽,¹牛奶和²鸡蛋标记肽,突显出一部分作为常见的缩写,量词转换以粗体显示。来源:PerkinElmer食品安全和质量

蛋白质	标记肽序列	前体(m / z)	保留时间(分钟)	产品(m / z)(片段)	CE	电动汽车	CCL2
αS1-Casein1	FFVAPFPEVFGK	692.9 (+ 2)	13.1±0.02	920.3 (y)8 +) 991.4 (y)9 +) 1090.4 (y)10 +)	-26年 -26年 -26年	15 17 25	-168年 -168年 -172年
	YLGYLEQLLR	634.6 (+ 2)	11.98±0.01	658.2 (y)5 +) 771.3 (y)6 +) 991.4 (y)8 +)	-28年 -28年 -27年	31日 23 24	-124年 -152年 -140年
β-Lactoglobulin1	山丘VDDEALEK	623.3 (+ 2)	5.8±0.01	572.5 (y)102 +) 819.1 (y)7 +) 1047.0 (y)9 +)	-30年 -29年 -30年	34 41 45	-164年 -196年 -170年
	VLVLDTDYK	533.2 (+ 2)	8.3±0.01	640.8 (y)5 +) 753.9 (y)9 +) 853.0 (y)7 +)	-24年 -22年 -22年	24 18 22	-108年 -100年 -100年
卵清蛋白2	GGLEPINFQTAADQAR	844.7 (+ 2)	8.9±0.01	1007.4 (y)9 +) 1121.2 (y)12 +) 1331.6 (y)10 +)	-51年 -40年 -35年	50 38 29日	-272年 -380年 -336年
	ISQAVHAAHAEINEAGR	592.1 (+ 3)	4.3±0.01	545.9 (y)5 +) 778.5 (y)7 +) 858.9 (y)8 +)	-40年 -31年 -29年	20. 42 30.	-200年 -128年 -204年
Vitellogenin-22	夹FAEYPTYK	671.6 (+ 2)	9.1±0.01	507.9 (y)4 +) 557.9 (y)92 +) 1114.9 (y)9 +)	-39年 -25年 -23年	33 25 25	-180年 -140年 -132年
	国家行业集团公司ELGVEK	479.7 (+ 2)	6.5±0.01	228.0 (b)2 +) 544.8 (y)9 +) 673.9 (y)9 +)	-18年 -24年 -21年	24 27 27	-88年 -124年 -120年

提供的冻干粉每个肽重组了100毫米的碳酸氢铵:乙腈80:20 (v / v)达到1毫克/毫升的浓度。

作为方法的一部分,绩效评估过程中,饼干参考资料(RM)牛奶过敏原检测得到监控和质量保证(MoniQA)在整个食品供应链协会。欧洲杯足球竞彩¹⁰

这个工具包包含以下样品:

• 消极的控制无谷蛋白甜饼
• 积极控制组成的干脱脂奶粉(SMP)和蛋白质含量进行验证
• 无谷蛋白饼干与SMP(3.53毫克/公斤)浓度较低的水平
• 无谷蛋白饼干与SMP高(17.7毫克/公斤)浓度水平

购买其他物品的范围使用的方法,包括:

• 全蛋粉(从西格玛奥德里奇购买)
• 脱脂奶粉(西格玛奥德里奇)
• 年级胰蛋白酶金女士(Promega)
• PD-10可支配脱盐墨盒(通用电气医疗集团生命科学)欧洲杯线上买球

样品进行了清理C18墨盒(50毫克/ 1毫升)。

样品制备

同时发生(脱脂奶粉和全蛋粉)和无过敏(过敏性成分取代)饼干是按照内部协议。¹¹参考材料成分的形式被欧洲杯足球竞彩适当合并为发酵过程的一部分。

图1所示。实验工作流程的同时检测牛奶和鸡蛋过敏原在饼干样品(改编自Monaci等。)¹²。图片来源:PerkinElmer食品安全和质量

商业饼干贴上“不添加牛奶和鸡蛋准备”由Galbusera SpA和分析。样品制备工作流程的总结在图1中可以看到,描述如下:

1. 蛋白质从碎饼干样品(产生过敏原免费和商业)提取与尿素Tris-HCl缓冲区200毫米7米的pH值9.2。
2. 结果提取过滤5μm醋酸纤维素膜。
3. 提取的蛋白质受到胰蛋白酶的消化了14个小时。
4. 消化是停在酸化(HCl 6米)
5. 最终消化在1800 x g离心10分钟之前收集上层的。
6. 胰蛋白酶的消化随后透过0.45μm再生纤维素(RC)过滤器。
7. 1毫升整除加载在C18 SPE柱(以前条件与甲醇和碳酸氢铵的50 mm)是用作进一步的纯化步骤。
8. C18-retained肽是用800μl 0.1%甲酸水溶液。
9. 然后他们被筛选了1.5毫升的甲醇/水(90/10 v / v)。
10. 收集到的分数是干下温柔的氮和悬浮在100μl 0.1%甲酸乙腈:水(挺,v / v)的解决方案。
11. 样品终于透过RC 0.45μm注射器过滤器。

硬件和软件

色谱分离进行了使用PerkinElmer LX50超高液相色谱(UHPLC)系统。

检测是通过PerkinElmer QSight 220 LC / MS / MS,配备APCI和ESI电离源。简单™3问软件被用于所有的仪器控制和数据的采集和处理。

方法、性能和评价

matrix-matched校准曲线制备的浓度范围0.0125 - 0.25μg /毫升,有四个浓度水平,每个重复测量。这是通过定义数量激增的合成肽股票的解决方案到无过敏的胰蛋白酶的消化饼干提取。

检测极限(LOD)和量化的限制(定量限)每个对应插值计算参数共产党连续和10的标准偏差分别行校准曲线的截距除以它的斜率。

食物过敏原检测的一个颇有争议的方面已经正确的规模来衡量污染水平。这个范围可以从过敏原标签作为一个整体成分,临床研究和潜在阈值水平指的是整体的过敏原蛋白质含量的问题。

先前的研究是利用建立以下转换因素。

开始合成肽浓度μg肽/毫升提取和应用逐步适用的转换因素,这些都是最终转化成μg总蛋白/ g矩阵(图2)。

图2。流程图的转换计算合成肽浓度(μg鸡蛋和牛奶_肽/毫升_提取)总蛋白浓度(μg_小孩防/ g_矩阵)(改编自Monaci等。)¹²。图片来源:PerkinElmer食品安全和质量

方法分析灵敏度等特性,恢复和处理效果和可重复性和再现性评估根据最终的报告单位。

方法精度评估是基于五个复制100μg过敏成分/ g矩阵污染水平样品盘中可重复性。这是重复3天来衡量inter-day再现性。方法恢复评估只有牛奶通过参考资料进行验证。欧洲杯足球竞彩

这个工具包提供的空白样品被用来生成一个新的matrix-matched校准曲线与合成肽。低和高产生样本进行了分析。百分比浓度比值测量和验证值被定义为复苏的方法。

性能评估方法根据采用AOAC公认的标准方法性能需求(SMPR)选择的食物过敏原的检测和定量。¹³

处理效果

评估选择的标记肽食品加工的影响,发生和发生材料准备。欧洲杯足球竞彩

发生的材料来自食品加工前加欧洲杯足球竞彩入空白的原材料。飙升的材料是由过敏成分添加到一个空白处理食品矩阵。¹⁴

在每种情况下,最终的浓度300µg过敏成分/ g矩阵是有针对性的。发生是一个甜饼矩阵富含3000µg / g过敏成分,这是1:10稀释与适量的无过敏饼干矩阵dough-making和烘烤过程之前。

相比之下,所涉及的飙升饼干的全蛋粉和脱脂奶粉到空白饼干切碎后烘焙和接地措施。

重要的参考剂量

的重要的系统建于2007年,旨在评价过敏原交叉污染的影响的方式量化,基于风险的方法,以促进决策过程关于适当的水平的预防过敏原标识和管理。

至关重要的从消费者输入后,成立行业和全球科学的风险评估部门,对过敏原的目的保护消费者敏感。

过敏原产生不良反应的概率取决于两个因素:过敏性蛋白质消耗的总体水平在一顿饭,和个人的过敏原致敏。

重要的系统依赖于三个重要值用于计算:

• 参考——部分的大小或数量最大数量的食物在一个典型的饮食场合
• 参考剂量-表达的总剂量毫克以下最allergen-sensitive消费者(1 - 5)在过敏人群可能会遭受不良反应
• 操作水平——食品中蛋白质浓度的阈值水平引导标识

行动1级意味着不需要预防标签。行动级别2的意思是“可能含有”标签是必需的。行动3级意味着“包含”标签是必需的。

信用证条件和参数设置

10μl最终提取的测量解决方案是注入到PerkinElmer Brownlee™验证水C18反相分析柱。信用证条件下采用表2中可以看出,和女士源设置在表3中可以找到。

表2。LX50 UHPLC参数。来源:PerkinElmer食品安全和质量

。	。
列	Brownlee验证水C18, 150 X 2.1毫米,3μm(部件编号:N9303539)
流动相	溶剂:0.1%的甲酸H2O 溶剂B:0.1%的甲酸甲醇
梯度	一步 时间(分钟) 流量(毫升/分钟) % % B 1 0 0.2 90年 10 2 17 0.2 50 50 3 17.2 0.2 10 90年 4 27 0.2 10 90年 5 27.2 0.2 90年 10 6 44 0.2 90年 10
注入量	10μL
烤箱的温度	30°C
Autosampler	10°C

表3。QSight ESI源参数。来源:PerkinElmer食品安全和质量

。	。
电离模式	应急服务国际公司在积极的电离模式
干燥气体	120年
HSID温度	250°C
喷雾器气体	300年
喷涂电压	+ 4000 V
源温度	400°C

源参数,包括温度、气体流动和位置设置,优化了最大灵敏度利用流动注射分析(FIA)准备合成肽的解决方案。

compound-dependent参数-碰撞能量(CE),入口电压(EV)细胞和碰撞镜头2电压(CCL2)——多反应监测(MRM)转换优化在流动注射分析肽(表1)。

结果

建立在LC分离和敏感的方法MS / MS分析建立同时检测鸡蛋和牛奶饼干矩阵过敏原。确保肽分离的色谱条件进行了优化。

最好的最高分辨率和整体运行时间之间的平衡进行了研究。

合成肽是利用优化方法和为每一个标记肽所选择。选择三个最强烈的多反应监测过渡期间的调优和流动注射分析阶段。

方法优化

验证缺乏从矩阵的背景干扰峰,一个空白的饼干样品制备。这样做是依照样品制备的协议。

样品与合成肽固定浓度上升。代表色谱分离的最佳条件下达到如图3所示。平均峰保留时间也会显示出来。

图3。代表总离子色谱图(TIC)记录在饼干矩阵合成肽肽浓度水平的0.166μg /毫升。图片来源:PerkinElmer食品安全和质量

性能参数线性方法,LOD和定量限

matrix-matched校准曲线的范围0.125 - -0.25µg /毫升证明特殊线性与R²> 0.999。利用这些校准曲线,定量限和LOD测定对应插值参数作为共产党连续10,分别行拦截的标准差除以斜率。

全面评价LOD /定量限的值转换发现了最好的量词识别标志及其最敏感的过渡(表4)。

利用转换因素,matrix-matched校准曲线值的值在µg肽/毫升提取被重新计算µg总蛋白/ g矩阵。每个后续的性能参数是指他们。

健壮的钟表低见0.1和3µg / g是牛奶过敏原,称为αS1-casein (FFV)和β-lactoglobulin (TPE)肽,分别。

蛋的钟表分别为0.3倍和3µg / g)获得的卵清蛋白(ISQ)和卵黄蛋白原——两个多肽(夹)。量词的典型色谱和限定符标记标识的四肽,在校准点最低的0.125µg /毫升,可以看到如图4所示。

图4。典型的色谱收购了饼干的合成肽矩阵:XIC quantifi er过渡的最敏感的标志肽的牛奶(A - FFV;C - TPE)及其相关qualifi er过渡(B - FFV;D - TPE)和鸡蛋,quantifi er转换(E - ISQ;G -夹);qualifi er转换(F - ISQ;H -夹),所有在一个水平的0.0125μg /毫升。图片来源:PerkinElmer食品安全和质量

根据关键阈值方法验证

需要良好的灵敏度分析方法在新秩序遵守或克服行动水平至关重要的项目。

这些行动水平定期修订新的变态反应学的相关数据,从临床研究。最近的重要项目的值从3.0版本修订,随后在2019年10月发布。

鸡蛋和牛奶有一个平等的参考剂量的0.2毫克总蛋白质。饼干的份量是估计为50克,给结果(会议行动级别1)总蛋白4毫克/公斤。

重要的是要注意,这种方法不仅灵敏度达到符合规定的值,但也能够检测即使是最小的数量的过敏原(约13 - 40倍低于行动水平¹将鸡蛋和牛奶蛋白,分别)。

精度

inter-day和盘中分析方法的准确性是评价评估方法的重现性和可重复性在同一个实验室(表4)。

表4。性能参数的方法。来源:PerkinElmer食品安全和质量

过敏的成分:蛋白质	标记	转换	LOD /(μg定量限小孩防/ g矩阵)	R2	RSDr % n = 5 第一天	RSDr % n = 5 第二天	RSDr % n = 5 第三天	RSDr %
牛奶:αS1-Casein	FFV	692.9/991.4	0.1/0.3	1.0000	2	1	6	4
牛奶:β-Lactoglobulin	山丘	623.3/572.5	3/8	0.9992	8	9	10 9
鸡蛋:卵清蛋白	ISQ	592.1/858.9	0.3/1	1.0000	2	5	2	4
鸡蛋:Vitellogenin-2	夹	671.8/557.9	3/9	1.0000	3	3	4	6

盘中重复性(RSDr)决定在五独立复制和在每种情况下,获得的值总是低于10%。相比之下,inter-day重复性(RSDR)是确定的时间3天,样品分析相同的强化。

获得的值低于9%的鸡蛋和牛奶量词肽在每一个实例。在95%置信水平单向方差分析测试来比较在不同的日子里获得的平均值。结果表明,肽标记没有显著差异。

评价处理效果

两种类型的样本相比,评估可能的食品加工影响的检测牛奶和鸡蛋肽标记:

• 飙升的样本,粉末形式过敏成分被添加到空白饼干烘烤后和接地过程
• 产生样本,dough-making前的过敏成分被添加和发酵过程

结果明显表明,食品加工可以影响所选标记的检测对于每个过敏成分的研究(图5)。

图5。烘焙proteotypic肽的检测能力的影响的牛奶和鸡蛋过敏原通过对比计算峰面积检测标记肽的产生和上升饼干污染在300年的水平/ gmatrixμg过敏成分。每个肽/过渡信号抑制由于b蛇行的百分比。图片来源:PerkinElmer食品安全和质量

计算处理效果表明,牛奶肽似乎容易发酵最高,与观测到的峰面积减少50%以上。相比之下,表明鸡蛋肽抵抗,表现出峰面积减少17%到26%。

真实

由于目前缺乏参考资料烤鸡蛋过敏原的食物,真实的评价仅限于牛奶过敏。欧洲杯足球竞彩

每个产生的样本——低(3.54µg / g)、高(17.7µg / g)进行了分析,一式三份。他们也把整个样品制备过程与参考样本(无过敏)饼干。

利用实验和理论值之间的比例比,估计方法的复苏牛奶过敏原。

方法恢复计算YLG肽被发现57±6%,56±7%和高浓度水平低,分别。计算使用的复苏FFV肽被发现57±4%和50±3%和高浓度水平低,分别。

符合采用AOAC公认SMPR 2016.002

性能评估方法按照最低性能特点提出采用AOAC公认的准则(SMPR 2016.002)的检测和量化过敏原采用质谱分析。

获得的结果的概述为每个参数表5中可以看到。

表5所示。比较方法的性能和设定的最低要求采用AOAC公认的SMP 2016.002过敏原检测食品中。来源:PerkinElmer食品安全和质量

参数	采用AOAC公认的方法性能要求		这个方法
	全蛋	牛奶	全蛋	脱脂牛奶
分析范围(ppm) *	10 - 1000	10 - 1000	4 - 90	4 - 80
MQL (ppm) *	≤5	≤10	2	0.9
MDL (ppm) *	≤1.65	≤3	0.7	0.3
复苏,%	60 - 120	60 - 120	附加说明	57±4
标准偏差r,%	≤20	≤20	≤5	≤6
标准偏差R,%	≤30	≤30	≤4	≤4

*报告为ppm目标过敏原在食品的商品,即25 ppm的“全蛋”饼干。

提供一个基础的比较,定量限和定量鸡蛋和标记肽的钟表一般为一个µg过敏成分/ g矩阵。指定的方法,开发了满足所有的需求。非常具有挑战性的定量限和钟表是获得两个鸡蛋和牛奶过敏的饼干矩阵。

样品测量

方法应用于样品获得各种大量的商用饼干贴上“准备没有添加的牛奶和鸡蛋。“这是进行评估的真正的没有任何证据鸡蛋和牛奶过敏,根据方法的敏感性。

鸡蛋和牛奶可以量化的峰面积的量词肽没有检测到。这表明没有检测这些样品的污染事故的灵敏度范围内开发的方法。

结论

本文概述了质/ MS方法的优化利用PerkinElmer QSight 220过敏原检测鸡蛋和牛奶饼干,被选为代表的复杂食品矩阵。

极具挑战性的LOD值和定量限被发现牛奶和鸡蛋过敏原,促进污染水平的检测一个点低于(级别1)参考阈值提出了牛奶和鸡蛋的重要项目(版本3.0)。

内部验证过程进行了分析功能提供符合规定的最低要求的采用AOAC公认SMPR 2016.002指南食品中过敏原的检测。

QSight 220 LC / MS / MS满足所需的灵敏度和选择性成功所必需的检测和量化的过敏原。

可以获得额外的信息在这个报告从相应的同行评议的论文发表。¹²

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确认

从材料最初由伊丽莎白·德旧金欧洲杯足球竞彩山罗克Guagnano罗莎Pilolli,和琳达从CNR-ISPA Monaci,粮食生产的科学研究所;欧洲杯线上买球阿里斯蒂德干柴和新Garaguso PerkinElmer公司。

这些信息已经采购,审核并改编自PerkinElmer食品安全和质量提供的材料。欧洲杯足球竞彩

在这个来源的更多信息,请访问PerkinElmer食品安全和质量。