鸡体内兽药的分析

由PerkinElmer食品安全和质量2021年8月11日

兽药以多种方式用于动物生产，包括治疗疾病、预防感染和保护动物生长。这有助于食品部门将高质量的食品推向市场，同时仍能盈利。

在动物生产部门对药物的不当使用可能导致食品中的残留违规。它还可能导致健康风险，因为人类和动物对抗生素产生耐药性的可能疾病。

在全球层面，监管机构已经确定了食品中兽药的最大残留水平(MRLs)或耐受性。欧盟(EU)、中国、加拿大和其他国家都设定了“食品中药物残留的最大残留水平”。美国称之为“容忍”。^{1、2、3、4、5所示}

目前，各种私人合同和政府实验室目前正在世界各地监测兽药残留物，以在国内水平施加规定，也是在国际粮食贸易中。

药物分析中一个常见的目标是在一次运行中，利用成本效益高的方法获得多个分析物的可接受结果。

建立这样的方法可能是一个挑战兽药在动物组织。这是由于样品矩阵的复杂性，以及来自不同化学性质类别的分析物的多样性。

以前，开发了兽药方法以分析密切相关的特定分析物或分析物组。仪器的选择性较少，需要大量的样品清理步骤。还需要许多单类方法来监测所有靶向药物。⁶

由于近年来高灵敏度、高选择性的质量检测技术和高性能分离技术的发展，单类方法逐渐被多类、多残留方法(MMMs)所取代。^{7、8、9、10、11、12、13、14、15日,16日,17日,18日,19}

本文概述了分析超过70种药品鸡的方法通过UHPLC / MS / MS手段的发展。

QuEChERS方法一直是首选食品样品中分析多残留兽药的提取方法。^7,8,15.最近的大多数研究使用简单的溶剂萃取，如乙腈和水的混合物(4:1 v/v)。^{9、10、11、12、13、14}

随后是各种样品清理步骤，旨在减少样品基质效应（例如脂肪、脂质和蛋白质）：

蛋白质在低温下沉淀¹⁶
使用己烷作为脱脂剂¹⁷
使用C18或其他吸附剂的分散固相萃取(d-SPE)样品清理^{8、9、10、11、12、13所示}
采用SPE筒与HLB¹⁸

适当的样品清理程序可以提高方法的性能，减少仪器维护的需要。然而，这将导致需要更大的劳动力投入，更长的分析时间和更多的费用来进行分析。

由于多级分析物的性质（包括不同的化学性质）在样品中，样品清理步骤可能导致某些分析物的低回收率。^{8,9,10,11,12,13,14}

在以前的研究中，为了用灵敏度较低的仪器达到必要的检测限，在LC/MS/MS分析之前，还需要蒸发浓缩的分析物和溶剂。^{7, 8, 9, 10, 11, 12}

本文介绍了一种快速、灵敏、有选择性地分析鸡肉样品中包括13种不同化学类别的73种兽药的方法，该方法采用溶剂萃取与LC/MS/MS相结合的方法。

当与不同的样品清理方法进行比较时，观察到所有的分析物在不进行样品清理的情况下都获得了较好的回收率。

QSight质谱仪的高灵敏度及其独特的StayClean™技术(热表面诱导脱溶- HSID™)和层流离子指南™允许直接分析20个样品提取物，而不需要耗费时间的溶剂蒸发和分析物浓缩步骤。

实验

硬件和软件

采用PerkinElmer UHPLC系统对兽药进行色谱分离。分析物的测定是使用带有双电离源的PerkinElmer QSight™220三重四极质量检测器完成的。

质量检测器能够快速切换，允许使用正极和负电离模式。借助于简单的3Q™软件系统进行仪器控制，数据采集和数据处理功能。

方法

溶剂，标准和样品制备

使用的溶剂和标准品来源如下：

从Thermo Fisher Scientific获得LC / MS级甲醇（MeOH），甲酸，水和乙腈（ACN）
羟基二甲硝咪唑，desethylene盐酸环丙沙星和盐酸吡利霉素（兽药）购自多伦多研究化学品来源（多伦多，加拿大）
haloxon从Cedarlane实验室(Burlington, ON, Canada)获得。
其余的内部标准品、兽药和试剂从Sigma Aldrich（加拿大奥克维尔）购买
这些鸡肉样品来自加拿大滑铁卢的当地杂货店。
从PerkinElmer公司获得用于d-SPE净化吸附剂管的AOAC 2007.01清理试剂盒(MgSO4 1200 mg, PSA 400 mg和C18 400 mg)
部件编号N9306911端封C18 d-SPE (500 mg C18)，从UCT (Bristol, PA, USA)获得。
Z-SEP +（500mg在12毫克）管中由Sigma-Aldrich（奥克维尔，加拿大）来源

每一种兽药标准品和氘内标品的原液分别是通过精确称重每一种标准品的5mg，并将其溶解在5ml的水、甲醇、ACN或二甲基亚砜中(取决于每一种化合物的溶解度)。

内标（IS）混合溶液，其包含三个内部标准（13C6-磺胺二甲基嘧啶，氟尼辛-d3和乙酰丙嗪-D3），每个在10μg/ ml时，制作由IS储备溶液在ACN适当的稀释的装置。

β-内酰胺/头孢菌素复合溶液在200X的水中生成，其中X代表最大残留限量。所有其他的分析物混合在复合溶液中，然后用ACN稀释到100倍。

复合溶液和原液在−20℃下存储。在验证实验中，加钉溶液的制备和使用在一周内完成。

在验证和分析过程中，采用每日稀释加标液的方法制作校准标准。每个标准溶液都储存在琥珀色玻璃瓶中，并用装有的PTFE密封(β-内酰胺类/头孢菌素类溶液除外，它们被储存在塑料瓶中)。

鸡肉样品均质，然后用干冰碾碎，得到均匀的粉末。在-20°C下保存过夜，以使残留的干冰升华，然后在-20°C下保存，直到进行分析。

将有机鸡肉样品作为空白基质进行方法验证。

将共计2克的样品称入离心管。它被添加了内部标准，并与目标分析物加强。然后用10ml提取液(乙腈:水:4:1 in v/v)提取样品。

经离心处理后，对提取液进行分析LC / MS / MS直接或在清理程序后。这是通过不同吸附剂的分散固相萃取(d-SPE)进行的。

然后，提取液被转移到清理管中。将提取液搅拌2分钟，离心5分钟(4℃)后，取最上层澄清的提取液进行分析，不过滤。

LC方法和MS源条件

的LC方法和MS源参数可以在表1中可以看出。

表1。液相色谱法和质谱源条件。资料来源:PerkinElmer食品安全和质量公司

信用证条件
液相色谱柱	Brownlee, SPP Phenyl-Hexyl, 100 x 2.1 mm, 2.7 μm (Cat#N9308485)
流动相一	0.1％甲酸的水
流动相乙	乙腈中0.1%甲酸和10%甲醇
流动相梯度(流速:0.4 mL/min)	以3%的B相流动起始，保持1分钟，然后在11分钟内增加B至100%，并保持100% B 2分钟。最后在初始条件下使柱平衡三分钟。
柱温	40ºC
自动取样温度	4ºC
注入量	3.0μL

女士源条件
ESI电压（正）	5000 V
ESI电压(负)	-4000 v
干燥气体	120
喷雾器气体	200
源温度	400ºC
HSID温度	320ºC
检测模式	时间管理MRM™

本研究中检测的兽药的多反应监测模式(MRM)变化见表2(按保留时间排序)。

表2。MRM转换。资料来源:PerkinElmer食品安全和质量公司

复合名称	极性	前体离子	生产	CE	电动汽车	CCL2
氟苯尼考胺	积极的	248.1	230.1	-17年	16	-50
氟苯尼考胺-2-	积极的	248.1	130.2	-29	16	-50
Hydroxy-dimetridazole	积极的	158	140.1	-17年	10	-56
Hydroxy-dimetridazole-2	积极的	158	112	-25年	10	-88
5-Hydroxy-thiabendazole	积极的	217.7	191.1	-33	46	-36
5-羟基 - 噻吩唑-2	积极的	217.7	147.1	-43	46	-36
左旋咪唑	积极的	205	178	-27年	31	-30
Levamisole-2	积极的	205	91	-49	31	-42
洁霉素	积极的	407.2	126.2	-36	18	-56
Lincomcin-2	积极的	407.2	359.1	-24年	18	-52
ALBZ 2-aminosulfone	积极的	240	133.2	-38	25	-63
ALBZ 2-氨基砜-2	积极的	240	198	-27年	25	-53
Sulfathiazole.	积极的	256.2	156	-19年	10	-34
Sulfathiazole-2	积极的	256.2	108.2	-36	10	-50
Desethylene环丙沙星	积极的	306.1	288	-25年	10	-90年
Desethylene ciprofloxacin-2	积极的	306.1	268	-35	10	-90年
土霉素	积极的	461.1	426	-24年	10	-100年
Oxytetracycline-2	积极的	461.1	201	-50	10	-128
磺胺甲基嘧啶	积极的	265.2	108.2	-38	28	-53
Sulfamerazine-2	积极的	265.2	172.1	-22年	28	-37
四环素	积极的	445.4	154	-35	19	-96年
四环素-2	积极的	445.4	410	-23年	19	-44
Enrofloxacin	积极的	360.4	316.1	-27年	38	-52
Enrofloxacin-2	积极的	360.4	245.1	-35	38	-47
Sulfamethizole	积极的	271.2	156	-19年	30.	-102年
磺胺甲基噻唑-2	积极的	271.2	92.1	-41	30.	-69
Orbifloxacin	积极的	396.2	295.3	-32	10	-75
Orbifloxacin-2	积极的	396.2	352.1	-25年	10	-40
磺胺甲嘧啶	积极的	279.2	186	-23年	10	-42
Sulfamethazine-2	积极的	279.2	124.1	-36	10	-44
磺胺二甲嘧啶-C13	积极的	285	124.1	-32	25	-100年
Sulfamethazine-C13-2	积极的	285	186.2	-23年	26	-100年
磺胺甲氧基吡啶啶	积极的	281.2	92.2	-47	10	-68
Sulfamethoxypyridazine-2	积极的	281.2	108.2	-35	10	-72
亚砜	积极的	282.3	240.1	-19年	22	-89
ALBZ sulfoxide-2	积极的	282.3	208.2	-31	22	-89
Sarafloxacin	积极的	386.1	342.2	-26年	36	-76
Sarafloxacin-2	积极的	386.1	299.1	-38	36	-98年
甲苯噻嗪	积极的	221	164	-35	25	-46
Xylazine-2	积极的	221	90	-29	25	-44
羟基 - Ipronidazole.	积极的	186	168	-16年	26	-24年
Hydroxy-ipronidazole-2	积极的	186	121.2	-36	26	－20
瘦肉精	积极的	276.8	203.2	－20	11	-144
Clenbuterol-2	积极的	276.8	132.2	-45	11	-61
Difloxacin	积极的	400.2	356.2	-26年	36	-60
Difloxacin-2	积极的	400.2	299.2	-38	36	-92年
莫仑太尔	积极的	221	123.1	-46	28	-74
Morantel-2	积极的	221	150.1	-38	28	-68
Morantel-3	积极的	221	111	-46	28	-74
6-苯基-2-硫脲嘧啶	积极的	205	188	-23年	30.	-36
6-Phenyl-2-thiouracil-2	积极的	205	146.1	-25年	30.	-42
吡利霉素	积极的	411.1	112.2	-35	28	-92年
Pirlimycin-2	积极的	411.1	363.1	-23年	28	-36
2-氨基 - 氟苯咪唑	积极的	256.1	123.1	-35	48	-60
2-Amino-flubendazole-2	积极的	256.1	133.2	-50	48	-88
Sulfachloropyridazine	积极的	285.2	156.1	-21年	25	-95年
Sulfachloropyridazine-2	积极的	285.2	92	-45	25	-62
克林霉素	积极的	425.4	126.2	-38	12	-80
Clindamycin-2	积极的	425.4	377.1	-30	12	-40
磺胺甲恶唑	积极的	254.1	92.1	-38	30.	-60
Sulfamethoxazole-2	积极的	254.1	108.3.	-39	30.	-70
Carazolol	积极的	299.3	116.2	-25年	31	-72
卡拉洛尔-2	积极的	299.3	222.2	-25年	31	-37
强力霉素	积极的	445.5	428	-24年	16	-68
doxycycline-2	积极的	445.5	267	-47	16	-112年
磺胺肟	积极的	311.2	92.2	-49	21	-60
Sulfadoxine-2	积极的	311.2	108.2	-37	21	-60
Sulfaethoxypyridazine	积极的	295.2	156	-25年	25	-50
Sulfaethoxypyridazine-2	积极的	295.2	92.1	-47	25	-66
ALBZ砜	积极的	297.9	159.1	-50	35	-70
ALBZ sulfone-2	积极的	297.9	266.2	-27年	35	-39
Oxfendazole	积极的	315.9	191	-29	36	-90年
恶唑-2	积极的	315.9	284.1	-25年	36	-33
Tilmicosin	积极的	435.4	174	-31	35	-94年
替米考星-2	积极的	435.4	99.1	-30	35	-54
替米考星-3	积极的	435.4	696	-23年	35	-94年
异丙硝唑	积极的	170	109.1	-33	25	-55
Ipronidazole-2	积极的	170	123.1	-33	25	-55
磺胺喹喔啉	积极的	301.3	155.9	-22年	30.	-48
Sulfaquinoxaline-2	积极的	301.3	108.1	-38	30.	-48
Sulfadimethoxine	积极的	311.3	156	-27年	28	-76
磺基嘧啶-2	积极的	311.3	92	-48	28	-64
强的松	积极的	359.1	147.1	-40	12	-62
泼尼松-2	积极的	359.1	171.1	-45	12	-68
Fenbendazole砜	积极的	332.2	300.1	-29	35	-54
Fenbendazole sulfone-2	积极的	332.2	159.1	-52	35	-94年
氟哌啶醇	积极的	376.1	165.2	-32	25	-68
Haloperidol-2	积极的	376.1	123.1	-50	25	-86
乙酰丙嗪	积极的	327.1	86.1	-25年	30.	-65
Acetopromazine-2	积极的	327.1	222.2	-50	30.	-115年
Acetopromazine-3	积极的	327.1	254	-35	30.	-115年
Acepromazine-dimethyl-d6	积极的	333	92.2	-27年	20.	-70
异丙嗪	积极的	285	86.1	-17年	25	-94年
异丙嗪-2	积极的	285	198	-33	25	-94年
阿苯达唑(ALBZ)	积极的	266	234.1	-26年	33	-45
阿苯达唑（ALBZ）-2	积极的	266	191	-44	33	-75
Mebendazole.	积极的	296.5	264.3	-29	30.	-110年
甲苯咪唑-2	积极的	296.5	105.1	-52	30.	-106年
氟苯达唑	积极的	314	282.1	-30	15	-44
氟苯达唑-2	积极的	314	123.1	-49	15	-94年
倍他米松	积极的	393.3	373.3	-12年	15	-48
Betamethasone-2	积极的	393.3	355.2	-18年	15	-58
Propionylpromazine	积极的	341.1	86.2	-25年	25	-52
Propionylpromazine-2	积极的	341.1	236.2.	-50	25	-102年
氯丙嗪	积极的	319	86.1	-26年	25	-60
Chlorpromazine-2	积极的	319	246.1	-31	25	-135
新青二	积极的	402.3	160	-27年	19	-78
Oxacillin-2	积极的	402.3	243.2	－20	19	-108年
Nitroxynil	负	288.8	126.7	32	-24年	70
Nitroxynil-2	负	288.8	162	25	-24年	60
Fenbendazole	积极的	299.9	268.2	-28年	34	-64
Fenbendazole-2	积极的	299.9	159.1	-47	34	-86
Triflupromazine	积极的	353	86.2	-27年	10	-52
Triflupromazine-2	积极的	353	248.1	-55	10	-122年
维及霉素	积极的	526.2	355.2	-23年	21	-78
维吉-2	积极的	526.2	337.1.	-29	21	-76
邻氯青霉素	积极的	437.3.	278.1	-19年	17	-116年
Cloxacillin-2	积极的	437.3.	160.1	-25年	17	-76
酮洛芬	积极的	255	177.1	-26年	25	-104年
Ketoprofen-2	积极的	255	194.1	-33	25	-104年
Oxyphenylbutazone	积极的	325.1	204.1	-22年	12	-48
Oxyphenylbutazone-2	积极的	325.1	120.1	-29	12	-44
萘夫西林	积极的	415.1.	199.1	-26年	25	-54
Nafcillin-2	积极的	415.1.	171.1	-49	25	-78
双氯青霉素	积极的	470.3	160	-28年	17	-72
双氯西林-3	积极的	470.3	311.1	－20	17	-126
氟尼辛	积极的	297	279.2	-29	30.	-50
Flunixin-2	积极的	297	236.2.	-55	30.	-150.
氟尼新-d3	积极的	300	282	-29	35	-35
Haloxon	积极的	415.2.	211.1	-46	42	-98年
Haloxon-2	积极的	415.2.	353	-29	42	-64
Triclabendazole亚砜	积极的	375	360	-30	25	-72
Triclabendazole Sulfoxide-2	积极的	375	313	-35	25	-156
双氯芬酸	积极的	296	215	-25年	28	-122年
Diclofenac-2	积极的	296	250	-15年	28	-134
苯丁基酮	积极的	309.1	120.1	-25年	10	-42
苯丁基酮-2.	积极的	309.1	188.1	－20	10	-40
Emamectin	积极的	886.5	158.2	-48	30.	-140
Emamectin-2	积极的	886.5	302.1	-40	30.	-144
Triclabendazole.	积极的	359	344	-34	25	-92年
三氯苯达唑-2	积极的	359	274	-48	25	-96年
Oxyclozanide	负	399.8	363.8	24	－10	90
Oxyclozanide-2	负	399.8	201.8	35	－10	70
氯硝柳胺	负	324.9	170.8	31	-25年	60
Niclosamide-2	负	324.9	288.9	24	-25年	60
美仑孕酮醋酸	积极的	397.4	337.3.	-18年	25	-54
美仑孕酮acetate-2	积极的	397.4	279.2	-26年	25	-62
脱酚酸	积极的	262	244	-22年	12	-44
托灭acid-2	积极的	262	209.1	-37	12	-70
双硫醇	负	354.9	160.8	27	－10	60
硫双二氯酚-2	负	354.9	162.8	33	－10	60
Closantel	负	661.1	315	41	-30	160
Closantel-2	负	661.1	344.9	47	-30	160

每个单一分析物至少监测两个MRM转换，以降低该方法中假阳性和阴性的数量。²¹

通过标准液的注入和软件的使用，优化了MS/MS参数，包括母离子、产物离子、入口电压(EV)、碰撞能量(CE)和碰撞电池前平面透镜电压(CCL2)的选择。

通过流动喷射（FIA）方法优化源条件。

使用优化的条件下，自动生成所述采集MS方法。

这是通过从simple软件的时间管理MRM模块的内置化合物库中选择感兴趣的兽药来完成的，包括目标分析物的正和负MRM转换。

结果与讨论

鸡组织样本中药物分析物和靶水平的选择

这项研究侧重于73种兽药来自13重要的类与一系列的物理和化学性质。

参考目标水平研究的最大残留水平(MRLs)建立了由加拿大卫生部食品中兽药或公差由美国食品和药物管理局建立在表3 (X)。检测阈值——“是/否”筛查水平应达到或者低于0.5 X。

表3。结果保留时间、基质效应(ME)、线性、加样回收率、重现性(%RSD)*。资料来源:PerkinElmer食品安全和质量公司

复合名称	毒品类别	X级别(ng / g)	RT(分钟)	我（％）	线性度（R2）	回收率(%)(非d-SPE)	恢复(%)(d-SPE)
氟苯尼考胺	苯上酚	One hundred.	1.34	-3.4	0.9999	88 (16) *	92 (18)
Hydroxy-dimetridazole	coccidiostats.	50	3.58	31.0	0.9993	90 (10)	103 (11)
5-Hydroxy-thiabendazole	打虫药	One hundred.	3.89	-59.9	0.9947	111 (13)	92 (17)
洁霉素	大环内酯类/ lincosamides	One hundred.	4.19	-5.6	0.9969	85 (11)	102 (7)
ALBZ 2-aminosulfone	打虫药	One hundred.	4.28	2．7	0.9998	108 (8)	87 (11)
左旋咪唑	打虫药	One hundred.	4.34	1．3	0.9989	89（10）	87 (6)
Desethylene环丙沙星	氟喹诺酮类原料药	One hundred.	4.51	-25.7	0.9988	113 (13)	4（18）
Sulfathiazole.	磺胺类药	One hundred.	4.55	-23.8	0.9997	104 (6)	95 (9)
磺胺甲基嘧啶	磺胺类药	One hundred.	4.82	-27.8	0.9999	110 (4)	98 (8)
土霉素	四环素	200	4.82	-14.5	0.9994	99 (12)	11 (15)
亚砜	打虫药	50	4.99	-1.7	0.9995	71 (4)	69 (9)
羟基 - Ipronidazole.	coccidiostats.	10	５．００	16.6	0.9955	107 (5)	107 (7)
四环素	四环素	200	5.05	13.0	0.9963	85 (2)	11 (17)
Enrofloxacin	氟喹诺酮类原料药	20.	5.13	-25.5	0.9997	78（11）	40 (14)
甲苯噻嗪	镇静剂	10	5.14	-13.6	0.9987	121 (9)	92（11）
磺胺甲嘧啶	磺胺类药	One hundred.	5.16	-16.6	0.9990	103 (10)	89 (8)
Sulfamethizole	磺胺类药	One hundred.	5.18	-6.6	0.9973	115 (7)	87 (5)
瘦肉精	β受体激动剂	10	5.19	4．7	0.9994	80 (12)	72 (10)
Orbifloxacin	氟喹诺酮类原料药	50	5.24	-18.1	0.9933	111 (14)	44（9）
磺胺甲氧基吡啶啶	磺胺类药	One hundred.	5.27	8	0.9988	120 (2)	103 (3)
Sarafloxacin	氟喹诺酮类原料药	50	5.40	-12.1.	0.9977	117 (4)	45 (6)
吡利霉素	大环内酯类/ lincosamides	300	5.41	-18.2	0.9994	102 (9)	88 (7)
6-苯基-2-硫脲嘧啶	Thyreostats	400	5.41	-12.1.	0.9999	117 (4)	93 (10)
莫仑太尔	打虫药	150	5.42	-13.1	1.0000	112（11）	89 (5)
Difloxacin	氟喹诺酮类原料药	50	5.48	-15.2	0.9998	106 (8)	90 (12)
2-氨基 - 氟苯咪唑	打虫药	10	5.59	2．2	0.9977	106 (3)	89 (6)
克林霉素	大环内酯类/ lincosamides	One hundred.	5.60	1．7	0.9997	99（8）	87 (11)
Sulfachloropyridazine	磺胺类药	One hundred.	5.76	-2.3	0.9992	109 (7)	103 (3)
ALBZ砜	打虫药	50	5.78	-15.3	0.9999	100（12）	98 (8)
Oxfendazole	打虫药	800	5.78	-21.7	0.9997	95（14）	83 (9)
Carazolol	镇静剂	10	5.83	-16.1	0.9975	117 (7)	122（13）
强力霉素	四环素	One hundred.	5.85	-6.1	0.9931	114 (11)	26（15）
磺胺甲恶唑	磺胺类药	One hundred.	5.86	-7.4	0.9998	110 (2)	92 (4)
磺胺肟	磺胺类药	One hundred.	5.87	-4.3	1.0000	92 (6)	101 (4)
Tilmicosin	大环内酯类/ lincosamides	One hundred.	5.89	-17.7	0.9991	119 (1)	95 (10)
Sulfaethoxypyridazine	磺胺类药	One hundred.	5.94	-9.5	0.9999	104 (5)	87（7）
异丙硝唑	coccidiostats.	10	5.96	-5.0	0.9965	115 (13)	101 (8)
Sulfadimethoxine	磺胺类药	One hundred.	6.41	-0.6	0.9989	94 (4)	89（10）
强的松	抗炎症	One hundred.	6.46	-5.4	0.9979	105 (3)	66 (9)
磺胺喹喔啉	磺胺类药	One hundred.	6.48	-1.7	0.9997	111 (6)	100（10）
阿苯达唑(ALBZ)	打虫药	50	6.53	-5.8	1.0000	100 (3)	93 (7)
Mebendazole.	打虫药	10	6.59	-11.5	0.9997	117（2）	77 (5)
Fenbendazole砜	打虫药	400	6.62	-2.6	1.0000	104 (6)	92（11）
乙酰丙嗪	镇静剂	10	6.64	-9.4	0.9999	118（2）	88 (9)
异丙嗪	镇静剂	10	6.68	-6.8	0.9890	95 (10)	33 (8)
氟哌啶醇	镇静剂	10	6.72	-4.8	0.9993	109（5）	98 (13)
氟苯达唑	打虫药	10	6.85	-10.6	0.9989	106 (4)	103 (11)
倍他米松	抗炎症	One hundred.	6.89	4．5	0.9982	110 (7)	126（2）
Propionylpromazine	镇静剂	10	7.10	-27.8	0.9994	121 (5)	85（8）
氯丙嗪	镇静剂	10	7.31	8．6	0.9993	92 (3)	68 (7)
Fenbendazole	打虫药	One hundred.	7.40	-13.6	0.9999	104 (7)	87 (5)
新青二	β-内酰胺/头孢菌素	One hundred.	7.43	０．３	0.9998	87 (6)	89（11）
Triflupromazine	镇静剂	10	7.53	3．8	0.9993	116 (4)	74 (11)
氟尼辛	抗炎症	20.	7.54	-3.7	0.9997	114 (3)	90 (10)
维及霉素	各种各样的	One hundred.	7.59	9.1	0.9903	109 (8)	118（3）
Nitroxynil	打虫药	50	7.72	-10.2	0.9990	84 (10)	71 (7)
酮洛芬	抗炎症	10	7.75	-9.0	0.9964	105 (13)	119（9）
萘夫西林	β-内酰胺/头孢菌素	One hundred.	7.88	22.6	0.9998	104 (7)	85 (4)
邻氯青霉素	β-内酰胺/头孢菌素	One hundred.	7.89	4．6	0.9999	103 (2)	96 (12)
Oxyphenylbutazone	抗炎症	One hundred.	7.89	17.3	0.9990	115 (5)	103 (8)
双氯青霉素	β-内酰胺/头孢菌素	One hundred.	8.23	-31.9	0.9992	88 (7)	79 (6)
Triclabendazole亚砜	打虫药	50	8.63	6．1	0.9989	96 (4)	88 (10)
Haloxon	打虫药	One hundred.	8.75	-21.8	0.9998	82 (3)	79（10）
Emamectin	打虫药	10	8.77	-15.1	0.9998	105 (12)	76 (19)
双氯芬酸	抗炎症	200	8.77	-18.5	0.9998	89 (9)	80 (5)
苯丁基酮	抗炎症	One hundred.	9.10	9.7	0.9999	117（3）	90 (5)
Triclabendazole.	打虫药	50	9.24	-17.9	0.9988	103 (5)	80 (14)
美仑孕酮醋酸	各种各样的	25	9.25	-20.0	0.9990	103 (4)	87（7）
Oxyclozanide	打虫药	10	9.30.	3．1	0.9997	111 (6)	78（11）
脱酚酸	抗炎症	200	9.42	-12.6	0.9991	88 (9)	67 (10)
氯硝柳胺	打虫药	10	9.43	-4.8	0.9991	107 (2)	85（9）
双硫醇	打虫药	10	9.90	-5.0	0.9973	87 (4)	59 (8)
Closantel	打虫药	50	11.68	-11.0	0.9995	93 (6)	86 (5)

UHPLC / MS / MS方法优化

不同的列和流动相条件进行了评价用于被靶向的化合物，以获得优异的灵敏度和分离。有人指出，三列可用于与不同略微保留时间轮廓的化合物的分离。

这些栏目是：

珀金埃尔默布朗利SPP苯基 - 己基柱（2.7微米，2.1×100mm）上
Restek Raptor联苯(2.7µm, 2.1 x 100 mm)
Waters Acquity UPLC HSS T3(1.8µm, 2.1 x 100 mm)

同样值得注意的是，10%甲醇在乙腈中作为有机流动相，在保留、分析物峰形和质量信号强度方面表现最佳。

当在有机流动相中存在10％甲醇时，质量信号强度显示出晚洗脱化合物的改善。

一种先进的时间管理的MRM采集方法能够智能地利用色谱峰的保留时间，并自动优化MRM的停留时间，以获得最高质量的定量数据。

因此，本研究将时间管理的MRM应用于方法开发，以提高方法效率、数据质量和提高方法性能。QSight质谱仪的快速极性切换能力允许在一次分析运行中对正离子和负离子进行高灵敏度检测。

样品基体效应

样品基质效应(MEs)是LC/MS/MS方法发展的关键问题。这在食品分析中尤其如此，因为食品样品基质的复杂性和多样性。

例如，ESI特别容易受到存在电荷竞争基质成分的分析物的电离抑制。²²此外，基质诱导的增强效应也已知发生在ESI中。这也会在量化上引入一个显著的偏差。

为了解决样品MEs的影响，使用了一系列的方法，例如，使用稳定同位素内标、样品稀释、基质匹配(MM)校准、样品清理、使用高效色谱柱改进分离、添加标准和使用替代电离源。^22,23

在每一种分析物的方法中应用稳定的同位素标记内标(IS)将在补偿MEs方面非常有益。然而，由于费用、可获得性和方便性的问题，这对于许多分析物是不实际的。因此，在实际应用中，一般采用MM标定来降低MEs。

本研究中的样品MEs是通过比较鸡样品基质和纯试剂(RO)基质的校准曲线斜率来评估的。

每个分析物的样品ME值的百分比由斜率之间的百分比差确定。当百分比差为正时，存在信号增强效应。负值表示信号抑制效果。

大约83%的研究分析物的MEs小于20%(图1和表3)。

样品基质对药物分析物的影响随保留时间的变化。

图1。样品基质对药物分析物的影响随保留时间的变化。图片来源:PerkinElmer食品安全和质量公司

值得注意的是，研究中剩下的17%的分析物存在me。其中一些表现出增强作用，如羟二甲硝唑和萘西林，但大多数在保留时间为3 - 10分钟时，几乎所有的分析物从色谱柱到检测器时表现出抑制作用。

这可能是由于MEs，不仅来自基质-分析物的竞争相互作用，而且来自混合物中众多的共洗脱分析物。²²

为了抵消基质效应并减少分析结果的变化，本研究中使用了基质匹配校准来量化每种分析物。

样品制备和回收

在用于确定食品中的化学残留物中的任何分析程序中，样品的制备中所涉及的时间和步骤一直是迄今为止的问题。

在每一种多类别、多残留方法(MMM)中，在清理样品导致的基质效应降低和清理过程中几种分析物的损失(低回收率)之间总是存在权衡。

所使用的清理步骤的数量越大，涉及的时间和成本越大，过程中丢失的潜在分析数越高。更少或没有样品清理将导致更多样本矩阵效应和更高的维护需求和成本。

来自美国农业部(USDA)的Lehotay小组发表了无数关于动物食品中兽药的mmm的论文。^{9、10、11、12、13、14}

该小组对牛肾脏的研究包括对文献中六种mmm的测试和比较。人们发现，每种方法的效果相当，尽管有些方法对某些药物类的效果要好于其他方法。然而，没有一种方法是理想的每一类药物评估。⁹

发生的实验显示，以下方法具有快速，直接和有效的样品制备方法：用10ml 4/1（v / v）乙腈/水的5分钟奶昔2g均质肾，其次是同时的用0.5g C18和10ml己烷的提取物清洗萃取物。

该研究还评估了用于分散固相萃取(d-SPE)清理的不同吸附剂，包括:

Aminopropyl
高分子吸附剂ENV +
炭黑

可以观察到，虽然所研究的吸附剂对基质组分的清理效果更好，但与C18相比，它们也导致了样品中更多的分析物的去除。

其他关于牛肌肉中100多种药物的实际方法的坚固性的研究，¹¹包括当时新的d-SPE吸附剂Z-Sep和Z-Sep+的测试，以及C18和端盖C18的测试。

研究了九种不同的净化条件，不同的d-SPE组合和/或己烷分配。

利用Z-Sep+和Z-Sep+己烷可以提供一种有效的去除基质成分的方法，同时也大大降低了许多研究药物的回收率。

利用终点C18 +己烷实现平衡基质效应和分析物回收方面最合适的折衷。

在最近的研究中,^12-14该小组没有使用正己烷进行清理，因为苯基丁酮、氧苯基丁酮和其他亲水性较差的药物会部分分割到正己烷中。这导致回收率低且变化不定。

该小组最近测试了一种被称为“增强基质脂质去除”(EMR-L)的方法。EMR-L是一种新产品，旨在选择性地从高脂肪食品样品(如动物源食品)中去除蛋白质和脂类。¹³

结果表明，与C18 d-SPE法相比，EMR-L法提取的成分更清洁，对一些极性较低的化合物(包括镇静剂和驱虫剂)的提取效果更好。

EMR-L法对β-内酰胺类抗生素和一些极性药物的回收率较低。

应当指出的是，相对于18 d-SPE当EMR-L方法包括额外的步骤。在四环素的情况下，是由C18 d-SPE和EMR-L的样品制备方法获得的低回收率。

建议使用四环素的稳定同位素标记，以补偿样品制备过程中的损失。^8、12实际上，C18 d-SPE方法比EMR-L方法更快、更简单、更具成本效益。

即使在封端的C18 d-SPE清理被采用的情况下，药物的大约75％所研究70-120％的范围内显示的回收率。一些极性较小的药物在含水乙腈提取物，其导致较低的回收率d-SPE期间留在C18吸附剂部分可保留。^12-14

并不是每一个极性基质成分和干扰可以通过研究到这一点任何清理方法去除。

这意味着，对于MMMs来说，减少基质效应和最小化维护需求的最合适的方法是稀释最终样品提取物或在色谱柱上注入少量样品。^{11,12,14,22,23}这也可以改进早期洗脱极性分析物的色谱法。

近年来，具有快速极性切换的现代高灵敏度质谱仪在商业上的可用性不断增长，这意味着这种方法现在是一种可行的选择，可以在不进行样品清理的情况下分析超过100种兽药。¹⁴

新LC/MS/MS系统的增强灵敏度有助于消除耗时的步骤（溶剂蒸发、浓缩和重组），这些步骤需要达到以前使用灵敏度较低仪器的MMMs的检测限。^7-11

虽然在LC分析前过滤样品萃取物是正常的做法(特别是UHPLC应用)，但应该仔细评估不同的过滤材料，以避免过滤器污染或分析物由于吸附到过滤器上而损失的风险。欧洲杯足球竞彩

前面的研究^{9、10、11、12、13所示}勒霍泰小组对四种不同类型的过滤器进行了评估。研究发现，聚偏氟乙烯(PVDF)过滤器的整体性能最好。

值得注意的是，该小组还发现，虽然过滤确实过滤掉了几种药物分析物，但也引入了预期的信号增强基质效应和样品基质中的干扰成分。^9,12,14

勒霍泰的研究人员选择将清理和过滤步骤从他们的最新方法中移除。通过使用现代仪器并注入少量样品，在不影响方法性能和维护需求的情况下，显示了更大的分析范围。¹⁴

本研究对不同的样品制备方法进行了进一步的评价。

回收率研究通过在两个浓度水平（0.5X和1X）下将分析物加入样品中进行。通过将强化样品的峰面积与基质匹配校准曲线进行比较，计算回收率。

分析物的平均回收率在70%到120%之间(表3)，在萃取物直接分析而不进行清理的情况下，大多数分析物的RSD < 20%。

在使用AOAC 2007.01清理工具(MgSO4 1200 mg, PSA 400 mg和C18 400 mg)进行d-SPE清理后，发现多类分析物的平均回收率较低。这些药物包括氟喹诺酮类、四环素类和几种镇定剂。

当使用端封C18作为d-SPE吸附剂时，也获得了类似的结果。这些结果与已发表的结果一致。^{8、9、10、11、12、13所示}

在d-SPE清理步骤中使用Z-Sep+吸附剂的结果不包括在这里，因为它们被发现与已发表的结果相同。¹¹

在0、0.1X、0.2X、0.5X、1X和2X条件下完成基质匹配(MM)和纯试剂(RO)标准品的线性、精密度和定量定标限。

其中X表示监管公差或限度(表3)，在UHPLC/MS/MS序列中，每个标准品重复注射的等效样品浓度被分散。

由反渗透系数和鸡肉样品基质构建的标定曲线具有良好的线性关系²)大于0.99(图2和图3显示了校准曲线的特征示例)。

仅在试剂中制备的标准品(分析物浓度范围为0.1X至2X)中获得的羟基双甲硝唑(A)、5-羟基噻苯达唑(B)、萘西林(C)和双氯西林(D)的校准曲线。

图2。仅在试剂中制备的标准品(分析物浓度范围为0.1X至2X)中获得的羟基双甲硝唑(A)、5-羟基噻苯达唑(B)、萘西林(C)和双氯西林(D)的校准曲线。图片来源:PerkinElmer食品安全和质量公司

从鸡肉样品基质(分析物浓度范围为0.1X至2X)制备的标准品中获得的羟二甲硝唑(A)、5-羟基噻苯达唑(B)、萘西林(C)和双氯西林(D)的校准曲线。

图3。从鸡肉样品基质(分析物浓度范围为0.1X至2X)制备的标准品中获得的羟二甲硝唑(A)、5-羟基噻苯达唑(B)、萘西林(C)和双氯西林(D)的校准曲线。图片来源:PerkinElmer食品安全和质量公司

通过按照2X标准注入试剂空白完成携带量评估。在任何实验中均未发现任何遗留物。该方法也被发现具有良好的精密度，几乎所有研究药物的RSD均小于20%。

该方法的定量限制（LOQs）是具有10的信号的浓度为10.发现所研究的药物的所有LOQs的所有LOQ都低于0.5×耐受性或最大残留水平（MRLS）。

结果表明，该方法是高度适合多类兽药残留的鸡样品中的快速筛选和定量。

样本分析

将所建立的方法应用于5个内标强化鸡肉样品中兽药的分析。根据保留时间和质谱信息(两个MRM跃进)与相应的参比标准品进行比较，未检测到所研究的药物。

结论

兽药在动物组织分析方法的开发是特别具有挑战性的，由于用大量的脂肪，脂质和蛋白质复合物基质的患病率。感兴趣的分析物残余物是尤其多样化的，不同类别来与一系列的化学和物理特性。

由于样品制备对色谱、电离和质谱分析的影响，它仍然是许多成功方法的基石。

然而，mmm中的样品清理更具挑战性，因为这一过程可能导致分析物损失，正如之前出版物和本研究中d-SPE清理的结果所证明的那样。

为了分析尽可能多的分析成为可能，平衡必须保证有足够的分析物的回收率和减少样品基体效应之间取得平衡。

随着商业可用性的增加和高灵敏度仪器的进步，稀释-喷射法可能会成为降低MEs的最有效方法，同时最小化仪器维护要求和增强MMMs中分析物的色谱。

这项研究强调了成本效益高的MMM用于鸡肉兽药分析的潜力。

此方法涉及耦合UHPLC系统采用QSight 220三联质谱仪，高度适用于鸡体内70多种兽药的快速筛选和分析。该方法还自信地宣称loq低于监管机构规定的限制。

从几个样品的制备方法的结果示出的是一个简单的直接注射法，没有样品清理提供了用于研究的所有化合物的最佳整体恢复，虽然有人指出样品基质可能会影响在分析柱的寿命。

它的保持清洁的离子源使灵敏的QSight 300系列质谱仪成为用户的理想选择，希望通过使用更多的样品稀释或更少的进样，以减少基质效应和提高方法的稳健性，同时确保不影响方法的可检测性。

工具书类

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美国心理学协会
PerkinElmer食品安全和质量。(2021年8月11日)。鸡体内兽药的分析。AZoM。于2021年9月5日从//www.wireless-io.com/article.aspx?ArticleID=20607检索。
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PerkinElmer食品安全和质量。《鸡肉中的兽药分析》。氮杂．2021年9月05日。。
芝加哥
PerkinElmer食品安全和质量。《鸡肉中的兽药分析》。AZoM。//www.wireless-io.com/article.aspx?ArticleID=20607。(2021年9月5日生效)。
哈佛大学
PerkinElmer食品安全和质量。2021鸡体内兽药的分析．Azom，查看了2021年9月05日，//www.wireless-io.com/article.aspx?articled=20607。

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