分析不同的牛奶中抗生素类

经常从事兽药抗生素作为生长促进剂和对疾病的治疗和预防。未经授权的使用抗生素会导致animal-originated食物残渣违规,包括肉类和牛奶,对人类健康构成潜在风险。

抗生素残留在食品会引发毒性和一系列的副作用,包括过敏反应、恶心和皮疹。长期食用食品的低水平的抗生素可能导致耐药细菌的传播。

因此,世界上每一个国家调节动物抗生素的使用。

加拿大和欧盟设定最大残留水平(MRLs)食品中药物残留,而美国是指这些公差水平。

牛奶中抗生素残留类使用和吸引监管利益包括磺酰胺类、氟喹诺酮类原料药,β-lactams、大环内酯类、四环素。表1提供公差范围在牛奶抗生素类的分析研究。

表1。的牛奶中抗生素不同的类及其公差极限。来源:PerkinElmer食品安全和质量

复合 抗生素类 公差等级一个
磺胺甲嘧啶 磺酰胺 10 ng / mlb
磺胺甲恶唑 磺酰胺 10 ng / mlb
Sulfadimethoxinef 磺酰胺 10 ng / mlb
Tilmicosin 大环内酯物 100毫微克/毫升c
泰乐菌素 大环内酯物 50毫微克/毫升
红霉素 大环内酯物 50毫微克/毫升
青霉素 β-lactam 5 ng / ml
邻氯青霉素 β-lactam 10 ng / ml
氧氟沙星 氟喹诺酮类 5 ng / mld
环丙沙星 氟喹诺酮类 5 ng / mld
Sarafloxacin 氟喹诺酮类 5 ng / mld
四环素 四环素 300毫微克/毫升e
金霉素 四环素 300毫微克/毫升e

一个宽容或安全水平牛奶从9/27/05 FDA / CFSAN牛奶安全备忘录1
b大量上市的“安全级别”不是一个宽容
c没有宽容的牛奶;方法目标水平集在100 ng / ml(肌肉公差)
d没有公差或已建立安全水平;方法目标水平设定为5 ng / ml
e宽容包括金额和个人残留;方法目标水平设定在100 ng / ml
f磺胺类药物的用法在泌乳奶牛(sulfadimethoxine除外)是被禁止的1

本文提出了一种快速、敏感LC / MS / MS法理想的定量和多层次牛奶中抗生素的确认分析。抗生素分析在这项研究包括:

  • 环丙沙星
  • Sarafloxacin
  • 氧氟沙星
  • 青霉素
  • 邻氯青霉素
  • Tilmicosin
  • 泰乐菌素
  • 红霉素
  • 磺胺甲嘧啶
  • 磺胺甲恶唑
  • Sulfadimethoxine
  • 四环素
  • 金霉素。

两个内部标准采用这种方法——ciprofloxacin-d8和flunixin-d3。修改,基本QuEChERS萃取的方法是利用一系列抗生素从牛奶。

演示的方法灵敏度好,恢复,线性,精度和选择性,使它适合于分析牛奶中抗生素的低容忍度水平定义为众多的监管机构。

硬件和软件

样品和样品制备

一个PerkinElmer阿尔特斯™UPLC®系统是用于色谱分离。这个乐器包括阿尔特斯30溶剂/样本模块、列加热器和真空脱气器集成。

一个QSight™210三重四极MS / MS检测器用于检测,而仪器控制、分析和数据处理都是通过简单3 q™软件平台。

方法参数

表2提供了LC方法的完整列表和女士源参数。

表2。LC方法和女士源参数。来源:PerkinElmer食品安全和质量

信用证条件
专栏: μm PerkinElmer Brownlee™SPP C18, 2.7, 2.1×100毫米(# N9308404部分)
流动相: 溶剂:5毫米甲酸铵,0.1%甲酸在水里
溶剂B:95%乙腈(ACN) / 5%与0.1%甲酸甲醇
时间(分钟) %的 % B 曲线
1 最初的 95.0 5.0
2 0.50 95.0 5.0 6
3 7.50 40.0 60.0 6
4 10.00 0.0 100.0 6
5 15.00 0.0 100.0 6
6 15.30 95年 5.0 6
分析时间: 12分钟;列洗时间有100%的B: 3分钟;re-equilibration时间:4.2分钟
流量: 0.4毫升/分钟
压力: 4200 psi / 285条(最大)
烤箱温度。 30ºC
注入体积: 10μL
样品温度: 7ºC

女士的条件
电离模式: ESI -积极
干燥气体(氮气)设置: 75个任意单位
HSID™临时: 320°C
电电压: 5500 V
源温度: 425ºC
喷雾器气体(氮气)设置): 175个任意单位
检测模式: MRM模式

溶剂、标准和样品制备

溶剂、试剂和稀释剂用于这项研究LC / MS年级,每一次抗生素Sigma-Aldrich提供的标准®Inc .,密苏里州的圣路易。这些都是储存在4°C在冰箱防止其退化。

股票激增和混合药物校准解决方案和准备在甲醇。这是所有抗生素的情况下,除了β-lactams,使用水作为溶剂。有必要存储β-lactam标准塑胶瓶,虽然其他抗生素标准可以存储在玻璃或塑料容器。

从Supelco吸附剂结束了C18收购,瓶保持在7°C的autosampler托盘,防止被分析物降解。所有股票和冷藏直到所需的标准工作,只有琥珀2毫升LC瓶使用。这样做也是为了防止退化。

两个内部标准用于校准和定量目的:ciprofloxacin-d8磺酰胺类、氟喹诺酮类原料药和四环素和flunixin-d3大环内酯类和β-lactams。

有机全脂牛奶样本作为控制当地市场被空白矩阵。五种不同类型的牛奶样品也与不同的脂肪含量调查分析抗生素的存在。一个基本的、修改QuEChERS方法用于样品制备。2、3

  1. 总共20毫升的有机溶剂(甲醇或乙腈)添加到5毫升的空白有机牛奶或牛奶富含不同级别的抗生素和内部标准15 ng / ml。
  2. 样品接受pulsed-vortexing 1分钟前在7800转离心10分钟。
  3. 浮在表面的删除,添加1.2克C18 dispersive-SPE脂肪去除。
  4. 样品进行了pulsed-vortexing 5分钟前在7800转离心5分钟。
  5. 总共12.5毫升的上层清液了,干到1.5到2毫升干燥氮气。这样做是约1小时40°C。
  6. 样品是用15%甲醇水重组将总量2.5毫升的提取。
  7. 提取是PVDF过滤器过滤(0.22µm)。

matrix-matched校准、强化和内部标准的解决方案是添加在步骤7提供等效样本中分析物浓度从0.1 ng / ml到1000 ng / ml。有五个复制在每个校准水平。

MS / MS参数

电喷雾电离在积极模式是用于所有残留的分析。源参数(例如源温度、气体流动和位置设置)进行了优化。

这样做是通过注入0.5µg /毫升溶液磺胺甲嘧啶µl 10点/分钟为挺水的流:乙腈0.1%甲酸和甲酸铵5毫米0.5毫升/分钟的流量。

解决方案为每个单独的残渣被注入0.5µg /毫升为每个MRM确定最佳的碰撞能量转换。四极峰宽度(Q1和Q3)设定在0.7阿姆河。

表3提供了参数对于每个MRM过渡,和三个MRM转换是监控每个抗生素残留限制假阳性和阴性的数量的方法。4

结果与讨论

表4总结了每个抗生素的校准曲线的定量限和回归值4。每个分析的定量限的抗生素被发现低于可接受的公差水平在100年牛奶的5倍。

表3。MS / MS LC / MS / MS方法的参数。来源:PerkinElmer食品安全和质量

被分析物 保留时间 保压时间 前体离子 定量离子 CE 定性离子1 CE 定性离子2 CE
磺胺甲嘧啶 3.37分钟 10毫秒 279.1 186年 20 V 156年 25 V 107.9 40 V
Sulfamthoxazole 4.38分钟 10毫秒 254.1 107.9 40 V 91.7 55 V 156年 30 V
Sulfadimethoxine 5.15分钟 10毫秒 311.1 156年 25 V 91.7 40 V 107.9 50 V
Tilmicosin 4.93分钟 30岁的女士 435.3 695.4 20 V 174年 30 V 87.9 55 V
泰乐菌素 5.70分钟 30岁的女士 916.5 174年 46 V 100.9 64 V 144.9 48 V
红霉素 5.41分钟 20女士 734.4 158年 40 V 576.2 22 V 115.9 66 V
青霉素 5.38分钟 30岁的女士 334.9 160年 22 V 176年 22 V 113.9 48 V
邻氯青霉素 6.6分钟 30岁的女士 436.2 277.1 18 V 113.9 62 V 178年 50 V
氧氟沙星 3.30分钟 10毫秒 361.9 317.9 25 V 343.9 25 V 260.9 35 V
环丙沙星 3.38分钟 10毫秒 331.9 313.9 24 V 230.9 51 V 187.9 75 V
Sarafloxacin 3.93分钟 10毫秒 385.9 367.9 28 V 341.9 24 V 298.9 36 V
四环素 3.52分钟 30岁的女士 445.1 410.1 16 V 154年 24 V 97.9 36 V
金霉素 4.33分钟 30岁的女士 479年 444年 26 V 462年 22 V 154年 36 V
Ciprofloxacin-d8 3.36分钟 10毫秒 340.1 235年 48 V - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Flunixin-d3 7.20分钟 10毫秒 300年 282年 30 V - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

表4。定量限和线性相关系数不同的牛奶中抗生素残留提取。来源:PerkinElmer食品安全和质量

复合 牛奶中定量限 校准曲线线性浓度范围 相关系数R2
磺胺甲嘧啶 0.1 ng / ml 0.1 -1000 ng / ml 0.9986
磺胺甲恶唑 0.1 ng / ml 0.1 -1000 ng / ml 0.9996
Sulfadimethoxine 0.1 ng / ml 0.1 -1000 ng / ml 0.9991
Tilmicosin 0.1 ng / ml 0.1 -1000 ng / ml 0.9990
泰乐菌素 1纳克/毫升 1 - 1000 ng / ml 0.9980
红霉素 0.3 ng / ml 0.3 -1000 ng / ml 0.9958
青霉素 1纳克/毫升 1 - 1000 ng / ml 0.9981
邻氯青霉素 1纳克/毫升 1 - 1000 ng / ml 0.9985
氧氟沙星 0.1 ng / ml 0.1 -1000 ng / ml 0.9982
环丙沙星 0.1 ng / ml 0.1 -1000 ng / ml 0.9978
Sarafloxacin 0.1 ng / ml 0.1 -1000 ng / ml 0.9968
四环素 0.3 ng / ml 0.3 -1000 ng / ml 0.9956
金霉素 0.3 ng / ml 0.3 -1000 ng / ml 0.9984

这证实,该方法足够敏感分析牛奶中抗生素在低公差的水平。

图1显示三个MRM转换为单一抗生素-磺胺甲嘧啶。这些都是在5 ng / ml水平飙升牛奶矩阵,证明一个好信号噪声。每个分析物的保留时间在±0.1分钟内被发现可再生的24小时内。

色谱图的三个MRM转换(一个quantifier-A和两个qualifiers-B C)磺胺甲嘧啶飙升在牛奶中提取5 ng / ml。

图1所示。色谱图的三个MRM转换(一个quantifier-A和两个qualifiers-B C)磺胺甲嘧啶飙升在牛奶中提取5 ng / ml。图片来源:PerkinElmer食品安全和质量

空白牛奶样本中掺入不同浓度的抗生素(0.1 -1000 ng / mL)来生成一个matrix-matched校准曲线。这样做是在九个不同浓度水平以及内部标准。

图2提供了一个示例对磺胺甲嘧啶校准曲线,显示了四个数量级。

校准曲线对磺胺甲嘧啶浓度范围从0.1到1000 ng / ml

图2。校准曲线对磺胺甲嘧啶浓度范围从0.1到1000 ng / ml n = 5每一层牛奶中提取。图片来源:PerkinElmer食品安全和质量

决心是线性校正曲线,标定的R2大于0.9958的所有分析物。表5显示了五个复制的特殊精密每个分析物的响应在不同浓度水平。

表5所示。重复性各级响应对抗生素残留的牛奶中提取。来源:PerkinElmer食品安全和质量

复合 2.5 ng / ml相对标准偏差
(n = 5)		 5 ng / ml相对标准偏差
(n = 5)		 10 ng / ml相对标准偏差
(n = 5)		 25 ng / ml相对标准偏差
(n = 5)		 50 ng / ml相对标准偏差
(n = 5)		 100 ng / ml相对标准偏差
(n = 5)
磺胺甲嘧啶 2.4% 2.4% 1.1% 1.4% 0.8% 0.7%
磺胺甲恶唑 3.5% 4.7% 2.8% 1.7% 2.9% 1.4%
Sulfadimethoxine 3.0% 0.8% 2.0% 1.6% 1.2% 1.7%
Tilmicosin 0.7% 1.5% 1.8% 0.7% 0.8% 1.1%
泰乐菌素 7.8% 4.3% 3.9% 2.1% 2.2% 1.4%
红霉素 4.7% 3.8% 4.0% 1.7% 2.3% 0.8%
青霉素 3.0% 4.4% 4.2% 1.4% 2.6% 1.5%
邻氯青霉素 4.5% 4.4% 3.7% 2.5% 1.8% 1.4%
氧氟沙星 2.9% 1.9% 2.6% 1.5% 1.7% 1.8%
环丙沙星 2.2% 2.3% 0.9% 3.1% 1.0% 1.1%
Sarafloxacin 2.4% 2.8% 2.0% 1.5% 2.0% 0.7%
四环素 6.1% 5.9% 6.1% 4.7% 2.8% 1.3%
金霉素 5.6% 5.0% 5.7% 3.6% 4.1% 2.1%

响应的数据突显出,RSD小于5%的浓度水平一半的每个分析物的耐受度或更高版本出现在牛奶中提取。

表6提供了一个简易的13个抗生素的复苏浓度水平接近公差限制牛奶中。绝对复苏的大环内酯类抗生素,磺胺类药和β-lactam类被发现在70%和120%之间,与RSD % < 20% (n = 5)复制样品。

绝对复苏对氟喹诺酮类原料药被发现在60%和70%之间,而绝对复苏四环素被发现在30%以下。——ciprofloxacin-d复苏为内部标准8和flunixin-d3——分别约为70%和90%。

由于氟喹诺酮类原料药和氘氟喹诺酮类原料药可能忍受类似的损失在提取过程中,可以使用一个内部标准来弥补降低氟喹诺酮类原料药的绝对的复苏。

复苏对氟喹诺酮类原料药和四环素(表1)已经纠正了损失在提取过程中通过使用内部标准ciprofloxacin-d8。

氟喹诺酮类原料药的复苏被发现在80%和110%之间,修正后使用氘氟喹诺酮类作为一个内部的标准,虽然这对四环素是30%左右。氘四环素可用于补偿四环素损失与这个提取过程在未来实验。

表6列出了利用一系列有机溶剂的影响在蛋白质沉淀,强调这些可能如何影响经济复苏从矩阵分析物和离子抑制。

表6所示。平均水平,为恢复和基体效应对不同抗生素从牛奶中提取不同提取溶剂(乙腈和甲醇)在蛋白质沉淀提取过程的步骤。来源:PerkinElmer食品安全和质量

复合 强化级别(ng / ml) 复苏与甲醇 复苏RSD为甲醇N = 5 基体效应与甲醇 复苏与乙腈 复苏RSD为乙腈N = 5 基体效应与乙腈
磺胺甲嘧啶 10 102% 8% 110% 101% 9% 102%
磺胺甲恶唑 10 103% 10% 93% 105% 13% 97%
Sulfadimethoxine 10 96% 7% 111% 104% 7% 106%
Tilmicosin 50 89% 10% 127% 82% 15% 103%
泰乐菌素 50 97% 14% 83% 92% 17% 97%
红霉素 50 98% 11% 80% 27% 17% 91%
青霉素 10 103% 10% 94% 84% 10% 96%
邻氯青霉素 10 94% 13% 97% 96% 13% 102%
氧氟沙星 10 101% 17% 163% 97% 1.7% 181%
环丙沙星 10 102% 16% 174% 87% 1.0% 163%
Sarafloxacin 10 104% 11% 162% 96% 9% 142%
四环素 50 32% 5% 152% 24% 5% 120%
金霉素 50 25% 8% 177% 21% 10% 130%

应该注意的是,复苏的所有分析物相似与溶剂、除了红霉素-复苏的红霉素与乙腈和甲醇约27%和98%,分别。

矩阵计算抑制和增强运用的比例在牛奶矩阵分析物的反应溶剂标准。样品制备时使用甲醇或乙腈,矩阵抑制和增强对磺胺类药是微不足道的,大环内酯类和β-lactams。

氟喹诺酮类原料药和四环素都表现出一定程度的离子增强的矩阵。平均而言,使用甲醇而不是乙腈导致更高的离子增强效果。这是有关矩阵对氟喹诺酮类原料药和四环素。

五个牛奶样品不同脂肪含量(1%到5%)强化内部标准。这些被筛选抗生素使用这里描述的方法。

保留时间和量词离子响应确认所有的目标分析物的抗生素被发现,即使是在一个水平低于方法的定量限的三倍(0.1 ng / ml) 1。

决定,RSD复苏的两个内部标准的牛奶样品与不同脂肪含量低于15%,说明,因此,牛奶的脂肪含量没有影响这些分析物的复苏在使用这里描述的样品制备方法。

而不是两个过渡,三个离子转换是监控,以确保准确的识别和确认。这种方法提供了两种离子比率,而不是一个产品,保证较高的选择性和特异性识别的提高。

离子比率计算峰面积测定的没那么强烈的离子峰面积更强烈的离子生成离子比例不到100%。

表7显示平均离子比率目标分析物。这些是在浓度水平的一半的宽容度在牛奶中提取宽容度的10倍。

表7所示。平均2离子比例及其范围的牛奶中抗生素残留在不同浓度水平提取。来源:PerkinElmer食品安全和质量

复合 离子比1 相对离子比1的区别 离子比2 相对离子比2的区别
磺胺甲嘧啶 57% ±5% 43% ±6%
磺胺甲恶唑 99% ±5% 90% ±6%
Sulfadimethoxine 38% ±6% 29% ±5%
Tilmicosin 76% ±5% 64% ±5%
泰乐菌素 44% ±6% 26% ±11%
红霉素 46% ±5% 24% ±6%
青霉素 78% ±5% 50% ±10%
邻氯青霉素 43% ±5% 38% ±6%
氧氟沙星 69% ±9% 62% ±7%
环丙沙星 43% ±5% 2.5% ±12%
Sarafloxacin 13% ±7% 8.1% ±7%
四环素 23% ±6% 21% ±10%
金霉素 68% ±6% 37% ±6%

相对离子比率在不同浓度水平被发现在±11%的平均离子比例——低于可接受的相对公差水平极限定义的±30% SANCO指导食品中化学残留物的分析。5

系统的长期稳定评估的6天注射牛奶有10 ng / ml的氟喹诺酮类原料药的提取时,磺胺类药,β-lactams 50 ng / ml的大环内酯类和四环素。

10 ng / ml的长期反应正常化的牛奶中磺胺甲嘧啶提取突出显示在图3中关于内部标准。

长期稳定性数据超过六天注射牛奶中掺入10 ng / ml的磺胺甲嘧啶。

图3。长期稳定性数据超过六天注射牛奶中掺入10 ng / ml的磺胺甲嘧啶。图片来源:PerkinElmer食品安全和质量

这对磺胺甲嘧啶是指出响应没有减少,甚至在6天的注射。这演示了三重四重MS / MS系统优秀的稳定性。

反应10的13个牛奶中抗生素残留提取显示没有注射的退化后6天,而响应三(红霉素、泰乐菌素和氧氟沙星)的13个抗生素残留被发现在6天将减少30%。这可以解释为已知的这些抗生素分解。

结论

本研究有效地演示了一个快速、健壮和可靠的LC / MS / MS法足够的选择性和敏感分析多个牛奶中抗生素类。

本研究使用一种修改QuEChERS样品制备方法,很简单,展示了良好的复苏对大多数抗生素类调查。

促进了目标化合物的识别和量化方法在低含量范围(0.1 - 1含量在牛奶展示良好的保留时间的稳定性和精度。

长期稳定性数据证实,一个LC / MS / MS系统能够用肮脏的矩阵分析样品没有任何停机检修时间。

引用

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确认

从材料最初由Avinash 欧洲杯足球竞彩Dalmia PerkinElmer, Inc .)

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  • 美国心理学协会

    PerkinElmer食品安全和质量。(2021年8月11日)。分析不同的牛奶中抗生素类。AZoM。2022年6月26日,检索来自//www.wireless-io.com/article.aspx?ArticleID=20610。

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    PerkinElmer食品安全和质量。“牛奶”的分析不同的抗生素类。AZoM。2022年6月26日。< //www.wireless-io.com/article.aspx?ArticleID=20610 >。

  • 芝加哥

    PerkinElmer食品安全和质量。“牛奶”的分析不同的抗生素类。AZoM。//www.wireless-io.com/article.aspx?ArticleID=20610。(6月26日访问,2022)。

  • 哈佛大学

    PerkinElmer食品安全和质量》2021。分析不同的牛奶中抗生素类。AZoM,认为2022年6月26日,//www.wireless-io.com/article.aspx?ArticleID=20610。

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