从2008年下半年开始，在牛奶中添加三聚氰胺以人为增加表面蛋白质含量的悲惨后果，突显了对早期检测掺假牛奶的筛查技术的要求。
目前有许多分析方法可以将牛奶和奶制品中的三聚氰胺含量降低到ppm甚至ppb(如ELISA和气相色谱质谱分析)，但如果要常规使用这些方法，将增加高成本和时间。
用红外分析实现ppm一位数的三聚氰胺检测限是不切实际的，但利用红外光谱可以有效地筛选三聚氰胺掺假乳脂计红外光谱同时在付款或进货时进行控制测试，消除了额外的分析成本和测试时间。
用n -凯氏定氮法或标准红外分析技术测定牛奶中三聚氰胺的含量时，牛奶中三聚氰胺的表观含量增加约4倍。
由于三聚氰胺在水中的溶解度有限(3 g/kg或3000ppm)，或12 g/l，牛奶的表观蛋白质含量仅能提高约35%。图1a显示了仅含有蛋白质的溶液(红色)和含有添加了2g/l三聚氰胺的蛋白质溶液(黑色)的红外光谱的相似度。
蛋白质的主要红外信号在两种光谱之间不同，以1545厘米为中心－1，但总的吸收模式似乎是相似的。由于牛奶主要成分和次要成分的自然变化，掺假牛奶的光谱更难与普通牛奶区分。生奶的光谱如图1b所示。
图1所示。图像信用：PerkinElmer食品安全和质量
除非对污染物的光谱有专门的了解，否则基于模式识别的筛选方法对于这些相当小的光谱差异是不敏感的。
图2显示了三聚氰胺在水中的两个吸收光谱。一颗位于1460厘米的中心－1与牛奶中尿素吸收最显著的吻合;另一个位于1560厘米的中心－1主要吸收蛋白质。
图2。图像信用：PerkinElmer食品安全和质量
通过ΔSctir的Delta Instruments BV基于频谱响应的紧密相似性和NPN与普通牛奶尿素的高相关性，由Delta Instruments BV开发了一种称为NPN /计算的尿素（NPN / Cu）。
利用该技术，通过乳镜傅里叶变换红外光谱(FTIR)确定的NPN含量，对普通乳中的尿素含量进行定量分析。对掺假牛奶中三聚氰胺含量的估计可以用同样的方法计算;这将称为NPN/计算三聚氰胺(NPN/CM)。
由于尿素和其他NPN组分，如氨(见图2)也有贡献，因此该方法的特异性受到一定限制。然而，由于它可以作为牛奶掺氨的早期预警，可以用NPN/计算氨(NPN/CA)表示，该方法可能有更广泛的用途。
由于认识到对三聚氰胺可能需要更大的特异性，因此也开发了全谱模型作为NPN/CM方法的替代方法。本文概述了这两种方法的适用性，并提供了三聚氰胺特定模型的性能细节。
PerkinElmer的研究表明，NPN/CM方法能够鉴别牛奶中添加的浓度为500ppm的三聚氰胺。三聚氰胺特定型号的检测水平进一步降低到100 ppm。
欧洲杯足球竞彩材料和方法
牛奶样本含三聚氰胺
为了保证脂肪、蛋白质和乳糖含量的最大自然变异，我们选择了两个板条箱(a & B)，每板条箱48个牛奶样品，并选择了荷兰主要牛奶控制站(“Qlip”)的所有牛奶支付检测样品(2008年10月初)。
在分析之前不久，将分析级三聚氰胺（Fluka）溶解在浓度为20-30g / L的浓度为20-30g / L的浓度为20-30℃，并在每种质量基础上加入牛奶样品，将其预热至40℃．
A条箱样品中添加了8种三聚氰胺;每级6个样本;约的水平。0、300、400、500、750、1500、3000、6000 PPM三聚氰胺。在B箱的样本中，三聚氰胺被添加了7个水平(N=49个额外的)，水平约为。0、200、400、600、1000、1400和1900 PPM三聚氰胺。
B箱样品按三聚氰胺正交添加7个水平的尿素;尿素水平大约。0、150、300、500、800、1100和1500 PPM尿素。
FPL牛奶校准装置
从Qlip收集了两个标准牛奶校准装置(FPL)，每个装置由脂肪浓度系列组成(F0..F8, 0 ~ 8% m/m)，蛋白质(P1..P5, 1.5 ~ 5% m/m)和乳糖(L1..在不添加三聚氰胺的情况下，对5月和7月两个产品的L5、3 ~ 5.5% m/m)进行了乳镜傅里叶变换红外光谱分析。
第二组通过正常和次正常均质器(分别为L0547和L0791)进行了两次分析。
用于评估的牛奶数据集
在荷兰一家主要干酪厂连续一年多(2006年1月至2007年5月)的生产过程中收集的(主要)牛奶光谱的大数据集(N>17000)用于评估目的。
样品(约。1%)，其中:
测量中断了
重复的被发现繁殖不良
3)蛋白质(< 0.5% m/m)、脂肪(奶油和重奶油)和乳糖(< 3%，>6 %)含量与乳有显著差异
计算NPN/CU、NPN/CM和NPN/CA
乳镜FTIR计算结果为NPN/计算尿素(NPN/CU)在ppm (mg/kg)自动从预测的非蛋白氮(NPN)的样品。在公式:
| 计算尿素= 1/a * (NPN - b) |
[１] |
其中a、b为常数，根据牛奶NPN含量对尿素进行预测后，于2004年进行的研究得出。
通过利用公式计算PPM中的NPN /计算的三聚氰胺（NPN / cm）的结果：
| 计算三聚氰胺= 1/fcm * (NPN/CU - 200) |
[2] |
其中，从NPN/CU结果中减去200ppm的值代表了对牛奶样品中尿素含量的估计。
fcm是三聚氰胺的响应因子，给定乳镜FTIR上NPN/CU的模型，从标准添加三聚氰胺到牛奶中确定(见结果和讨论，图3a,b)。
NPN/计算氨(NPN/CA)在ppm氨(mg NH3/kg)中的计算结果相似，采用公式计算:
| 计算氨= 1/fca * (NPN/CU - 200) |
[3] |
其中，在给定的乳镜NPN/CU模型下，通过向牛奶中标准添加氯化铵(以mg nhh3./ kg牛奶，如图7a和b所示。板箱A的牛奶样中的中值尿素含量由200的值表示，如上所述。
三聚氰胺模型开发与统计
采用Grams/PLSIQ软件建立了特异性高的全光谱红外模型。校准装置由B箱样品和FPL装置组成。
每次分析都有一个单独的重复(重复或更多)。
添加到B箱中的三聚氰胺与额外添加的尿素呈正交关系。表1显示了箱B的描述性统计以及箱B单独和校准集的成分之间的相关性。
表2。资料来源:PerkinElmer食品安全和质量公司
通过交叉验证(循环，每次剔除一个样品)确定最佳因子数，得出交叉验证(SECV)的标准误差。
首先，根据添加到A箱的三聚氰胺的结果对模型进行验证，计算出预测的标准误差(SEP)，并修正了斜率(SEP *)的轻微偏差(±1%)，这归因于样品制备中的分析误差。
对牛奶生产数据集的再分析进行了进一步验证。包括酸牛奶样本在内的数据集就是其中之一，经确定，三聚氰胺作为pH值的函数的预测值存在一定的误差。
根据这些数据计算出了一个pH值校正值，并应用于这里报告的所有三聚氰胺结果，称为“三聚氰胺(pH值校正)”。
PH校正模型的最终验证是基于超过17000多个样本的生产牛奶数据集，该样本聚集在一个主要的奶酪植物的另一个口腔桥。三聚氰胺响应中的平均值和标准偏差（SD）整体上的该数据集定量。
结果与讨论
NPN /配置管理方法
牛奶中的尿素含量是根据上述公式[1]通过斜率/截距计算的非蛋白氮含量(NPN)的红外光谱测定来计算的，在Combi和FTA乳镜FTIR版本中称为“NPN/CU”。
图3。NPN /铜& NPN /厘米。图像信用：PerkinElmer食品安全和质量
该模型能较好地预测普通牛奶中尿素的含量。由于在校准中使用了广泛的牛奶样品，包括从荷兰各地收集的单个和牛群牛奶样品，NPN/CU模型被认为是稳健和坚固的。
该方法的准确性主要取决于牛奶中尿素与NPN的密切关系。
在普通牛奶的基础上开发的任何牛奶中NPN或尿素的模型都有望显示添加三聚氰胺的强烈反应，因为在水中对尿素的吸收最显著，而对三聚氰胺的吸收在1460厘米的中心位置有很强的重叠－1(图2)。
对于添加到A箱样品中的三聚氰胺，也观察到这种情况。NPN/CU结果如图3a所示，是添加ppm (= mg/kg)三聚氰胺的函数。
不添加三聚氰胺，NPN/CU平均约为。200ppm(或200mg尿素/kg牛奶)，牛奶中尿素的正常含量，在本例中a箱样品中尿素含量的中位数。
添加300ppm三聚氰胺后，NPN/CU读数平均上升到650ppm。当NPN/CU中加入500 ppm时，响应增加到900 ppm。
对于普通牛乳，800ppm或更高的尿素值并不经常观察到，所以在使用NPN/CM方法时，对被认为“可疑或不可疑”的样品的鉴别上限可以设置为500ppm或0.05% m/m三聚氰胺添加到牛奶中。
根据NPN/CU尺度上三聚氰胺响应的斜率(“fcm”)为1.5，尿素的中位含量为200ppm，根据公式[2]将结果重新划分为图3b中NPN/计算三聚氰胺(NPN/CM)的结果。
该图中y=x的偏差很大程度上反映了样品中尿素含量的自然变化。
全光谱三聚氰胺方法
已开发了一个全光谱模型来检测牛奶中的三聚氰胺，具有更好的特异性，可以替代NPN/CM方法。
使用的校准装置包括以正交方式添加三聚氰胺和尿素的B箱牛奶样品，以及三套称为FPL的牛奶校准装置(见材料和方法)。欧洲杯足球竞彩
图4A示出了箱式样本B的交叉验证的结果。通过17ppm的标准误差表征（SECV，计算在完整集上），观察到线性关系。所有点均落在Y = X线上，无论添加到样品中的尿素量（0到1500 ppm），如图4a所示。
图4。三聚氰胺特定模型。图像信用：PerkinElmer食品安全和质量
所以当使用全谱模型时，三聚氰胺响应不受尿素的干扰。在牛奶中加入500ppm nhh的氨的干扰也同样存在3.以NH的形式存在4.Cl。
另一方面，发现牛奶的溶解对三聚氰胺读数产生不利影响，而是通过掺入pH校正来容易地校正。报告的三聚氰胺特异性模型的所有数据被纠正，结果被称为“三聚氰胺（pH校正）”。
如图5所示的校准集样品的残留物加强了三聚氰胺响应的独立性，作为尿素含量的函数以及脂肪，蛋白质和乳糖含量超过0至8％脂肪（F0..f8），1.5〜5％蛋白质（P1.. P5）和3至6％乳糖（L1..L5）。
图5。三聚氰胺校正残差。图像信用：PerkinElmer食品安全和质量
基于条箱A的样本的验证，其中图4B中给出了曲线图，显示出良好的线性度和准确性，响应于高达6000ppm三聚氰胺的范围。
表2显示了三聚氰胺特定模型的统计数据摘要。对A箱样品(N=36，最高1500ppm)的校准标准误差(SEC)和预测标准误差(SEP)的标准误差均为21 ppm，即排除添加高达3000和6000ppm的2*6个样品)。
表2。资料来源:PerkinElmer食品安全和质量公司
重复或重复分析样品连续测定的重复性标准偏差(SDrep(i,i+1))通常为10 ppm。
进一步验证的基础上一套牛奶收集在一年多的17000多个分析收集从一个大奶酪工厂在荷兰显示平均响应的三聚氰胺10 ppm值16 ppm标准偏差的结果。
图6。乳集（N≈17000)。图像信用：PerkinElmer食品安全和质量
图6A显示了三聚氰胺（pH校正）的结果的图。虽然大多数分析的样品只是牛奶样品，但发现该集合物被发现包括更多的样品，分析的牛奶样品的变异性相当大。
这是通过脂肪结果图所示的图6c。它表明，大多数样品的脂肪含量约为4％，或在另一个离散水平下，例如，接近2％或0％的脂肪，但脂肪的范围从0次达到8％。一些样品在组合物中更加极端（参见材料和方法）。
三聚氰胺（pH校正）的大部分结果下降在±50ppm的0 ppm窄范围内。在负方向上观察一些外围点，但数量仍然可以忽略不计。最高结果出现91ppm，前面（一天）之前，响应为73 ppm之前不久。
然而，这两种结果都包括乳清样品，其中大约有20个样品在这一组中，三聚氰胺的平均反应是46 ppm，结果的标准偏差是19 ppm。
可以得出结论，可以通过大约50ppm的简单偏压校正来制造与乳清等矩阵的适应。这使我们得出结论，可以在100ppm上安全地将歧视限制安全地设置为“怀疑与否”，用于三聚氰胺（PHCorr）。
图6b中未污染牛奶组的结果说明了为什么NPN/CU限制不能像全光谱模型那样低。选择500ppm的限制当然是安全的，如果图6d中NPN/CU含量的变化停留在100 - 400ppm的尿素带中，具有一定的季节依赖性，那么这个限制甚至可能会有所降低。
NPN / CA方法
最后，对NPN/计算氨(NPN/CA)进行了研究。图7a显示了牛奶中NPN/CU响应的增加与氨(NH)的关系3.)以氯化铵(NH4.Cl，即，乳汁样品的pH保持中性的形式）。
图7。NPN /铜& NPN / CA。图像信用：PerkinElmer食品安全和质量
结果落在直线上，因为氯化铵以不同量加入到单一的新鲜牛奶样品中。线（FCA）的斜率为2.1，以ppm尿素表达与ppm氨。
根据Material & Methods的[3]方程进行重新缩放，得到如图7b所示的NPN/CA值。在这种情况下，按照NPN/CM案例中使用的推理思路，添加氨“掺假或不掺假”的鉴别极限可以设置为350 ppm。
当使用标准的红外分析技术时，添加尿素或添加氨都不会导致更高的蛋白质读数，而n -凯氏定氮法显示，当在牛奶中添加氨时，蛋白质读数会升高。
然而，NPN/CA方法在检测这种形式的掺假是有价值的，如果氨(以nhh的形式)4.OH)，可恢复酸牛奶的pH值，以掩盖其不良品质。
结论
本工作表明，利用NPN/CM方法在乳镜FTIR上筛选原料奶中三聚氰胺浓度降至500ppm或0.05% m/m的可行性。
利用三聚氰胺特异性检测模型，可进一步降低鉴别限至100ppm (0.01% m/m)。
添加的三聚氰胺只有在添加足够的量使表观蛋白质含量(通常为3%)分别提高0.2% m/m或0.04% m/m时才会被检测到，因为三聚氰胺(%m/m)的红外倍数在3至4之间，基于红外蛋白质(%m/m)的结果。
这些信息来源于PerkinElmer食品安全和质量公司提供的材料。欧洲杯足球竞彩
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