苹果汁中砷的完全分离与准确定量

苹果汁被认为是人工调味和碳酸饮料的健康替代品，这使它成为许多家长给孩子们的首选，并被认为是维生素、矿物质和纤维的宝贵来源。¹

但是，一些关注的问题已经在存在方面表达砷在苹果果汁²由于自然高水平和砷在杀虫剂中的历史使用，其中来自这种应用中的砷可以在使用后几十年来留在土壤中。

这对涉及儿童的暴露是特别关注的，因为孩子患有比成年人更极端剂量的剂量响应。^3.

虽然从完全分析砷获得的信息可能是有用的，但是由于砷的各种化学形式具有不同水平的毒性，因此它也可能产生关于毒性的偏差视图。

相对而言，物种形成研究能够提供大量关于毒性的信息，因为这是相对于目前的化学物种和每个相关物种的丰度而言的。

就砷而言，毒性最大的形式是无机形式(亚砷酸[As III]和砷酸[As V])，而甲基化形式(二甲基砷酸[DMA]、单甲基砷酸[MMA]等)毒性较小。

结果，由FDA确定的苹果汁中无机的动作限制为10μg/ L，^4.由于浓度大于这一点，发现儿童的毒理学应答。^1,2,3,5.

诸如HPLC的色谱技术通常用于将各种化学物质分离，其中ICP-MS是许多分析实验室的优选检测器。

这是因为它具有较宽的线性动态范围，较低的检测限，并具有解决复杂干扰的能力。

对于除砷以外的分析物，ICP-MS在解析各种元素同位素方面的额外能力允许用户使用同位素稀释方法，这可以极大地提高分析的准确性。

HPLC-ICP-MS用户面临的一个挑战是，大多数应用程序在强酸性中使用盐缓冲液^6,7.或强大的基础^9.使流动相建立了对各种化学物质感兴趣的元素的基线分辨率。

在基于钢铁的系统中，过度条件可能导致硬件腐蚀，长期使用，包括泵和自动进样器的磨损;在与流动相接触的组件中，这种效果将更加明显。虽然这些系统可以通过用20％HNO冲洗而相当钝化_3.，仍有腐蚀潜力。^10.

任何铁锈堆积都可能会脱落，有时会堵塞和不可逆地损坏昂贵的柱子。

然而，当利用具有惰性的HPLC系统时，可以有效地防止这种无金属流体路径，这将消除生锈形成问题。此外，使用这种设计将保证背景对于其他分析物中的背景较低，这通常是分析兴趣，例如Cr和Fe。

用户克服的额外障碍是尽管良好的泵实践，但包括在每天结束时用弱有机溶液冲洗泵，盐晶仍然可以在泵密封件后面积聚。这可能导致密封损坏，影响分析结果，从而提高维护成本和仪器停机时间。

通过使用具有后密封洗涤能力的HPLC泵可以缓解此问题，意思是积极洗涤泵密封，以减少密封磨损。

在整个研究中，使用一种HPLC方法进行商业苹果汁中的四种砷物种的表征，该方法是开发的，以实现快速和可重复的分离和分析物种的低浓度。

ernstberger开发的已验证和信誉方法等．^7,8用于量化苹果汁中常见的不同砷种类(As III, As V, DMA, MMA)，从而评估其潜在毒性。

使用PerkinElmer Nexsar™HPLC-ICP-MS解决方案进行该分析，该溶液由惰性Nexsar形态分析成立的HPLC系统与Nexion配对组成^®ICP-MS，其中洗脱采用NexSAR柱箱恒温控制。

实验

样品制备

使用以下试剂在流动相中进行浓度为0.1,0.5,1,5,10和20μg/ L的校准标准物的制备：As（iii）从999±5mg / L arsenite（无机Ventures Ltd。，弗吉尼亚州，美国弗吉尼亚州，弗吉尼亚州，As（v）从1003±6 mg / L砷酸盐（无机企业），来自卵育酸的DMA（≥99.0％，Sigma Aldrich，Sigsouri，Missouri，USA）和MMA1000 mg / L MMA（Chemservice，West Chester，宾夕法尼亚州，美国）。

选择这些品种进行评估是因为它们在过去涉及苹果汁分析的研究中被证明存在。^6,7.选择的浓度反映了FDA围绕无机砷的当前行动水平制定的浓度范围。^4.

使用先前已经证明的酸性流动相（pH 4.0）进行了分析，该方法是最合适的方法，该方法适当地反映苹果汁的pH，同时也能够维持各种砷物种的完整性。^7.从当地的杂货店购买了四个流行的商业生产的苹果汁。

没有人注意到这些果汁的保质期。这是因为众所周知，在商品级苹果汁中，各种化学物质在长时间的储存过程中保持平衡，并且是稳定的。^6,7.

在取样之前剧烈摇动果汁以确保均匀性，并且50ml每个苹果汁通过0.45μmPTFE过滤器（亲水，Millex，Sigma Aldrich）来消除任何不需要的颗粒物质。

对未稀释的样品进行了分析。在整个研究过程中，不断进行校准标准，并将四份苹果汁样品倒进多个不同的塑料高效液相色谱瓶中反复分析。

每次苹果汁样品后用空白样品进行评估，以检查样品之间的结转情况。在没有认证的标准物质的情况下，通过用每个物种(As III, As V, DMA, MMA)的2µg/L和10µg/L的样品来确保准确性。

仪器

所有分析评估都使用a进行Nexsar形态分析Ready HPLC系统(PerkinElmer Inc.， Shelton, Connecticut, USA)，其中包含NexSAR 200惰性高效液相色谱泵，NexSAR冷却惰性自动进样器，NexSAR脱气溶剂托盘和NexSAR柱烤箱(PerkinElmer Inc.)。

该系统与Nexion ICP-MS配对（PerkinElmer Inc.）配对。与HPLC和ICP-MS条件有关的细节分别根据先前的工作在表1和2中展示。^7.

在该方法的开发期间，监测M / Z 75和77以保持注意力⁷⁵ARCL.⁺干扰⁷⁵作为⁺．没有ARCL.⁺检测到，以标准模式分析样品以进行研究的其余部分。使用Clarity™软件版本8.1进行所有分析和数据采集。

表1。NexSAR惰性HPLC系统条件。资料来源:PerkinElmer食品安全和质量公司

范围	价值
色谱法	反相离子配对色谱
移动阶段	离子配对试剂
pH值	4．0
分离方案	is
注入量	20μL
LC小瓶	HPLC测试PP小瓶，1.5毫升

表2。Nexion ICP-MS仪器条件。资料来源:PerkinElmer食品安全和质量公司

范围	价值
喷雾器	梅哈德斯坦®C型玻璃
喷雾室	玻璃旋运
射频功率	1600 W.
注射器	2.0 mm ID石英
喷雾器流	优化<2%的氧化物
模式	标准
停留时间	100毫安
采样率	10分/秒

结果与讨论

0.1 - 20µg/L As V、MMA、As III和DMA的相关系数分别为0.99990、0.99999、0.99999和0.99998(图1)，图2为校准标准品的交点。

后者（图2）突出了泵提供的可靠和一致的流速，并表明存在保留时间的异常再现性，无论浓度如何。

由于NexSAR高效液相色谱系统是无生命的流体通道，As的色谱基线不重要，对于不同化学物种的As, 0.1 ppb标准的信噪比(S/N)在12到7之间。

图1。(a) As V、(b) MMA、(c) As III和(d) DMA在0.1 ~ 20 μg/L范围内的线性回归及其相关系数。图像信用：PerkinElmer食品安全和质量

图2。色谱图显示校准标准(0.1 - 20 μg/L)在(pH 4.0)流动相覆盖。图像信用：PerkinElmer食品安全和质量

这有利于在低于FDA作用限制的浓度下检测，并且还可以容易地量化诸如MMA的低水平存在的化学物质。这至关重要，因为检测以低浓度存在的化学物质提供了更全面的毒性视图。

在利用质量平衡方程的研究中，量化痕量分析物的能力将显着改善分析物回收，从而提高了这种结果的整体质量。

图3。色谱图显示来自不同样品小瓶的四个未稀释的苹果汁样品的四个注射（20μl）。图像信用：PerkinElmer食品安全和质量

由于事实，在未稀释的样本中实现可重复的结果有时可能会挑战苹果汁是一个复杂的矩阵。在该研究期间，观察到来自各种样品小瓶的相同样品的注射，以表现出卓越的再现性（图3），所有分析物的相对标准偏差（％RSD）百分比小于2％。

低色谱基线和脉动被认为对样品和校准标准都无关紧要，这表明了该技术在各种基质中的强度，以及hplc测试的塑料瓶在这种应用中的有效性。

覆盖层还揭示了注入体积的重复性，每次注入都有近乎精确的响应。值得注意的是，较好的溶剂和化学品质量可以降低色谱基线(S/N)。

无论如何，图3显示了低PPPT分析物可以精确地量化，其中v，MMA为III和DMA的浓度分别在该特定样品中分别为0.94,0.09,0.77和0.20μg/ L，以及S /N对于最低浓度分析物（MMA）为6。

图3还说明，在苹果汁中检测到的四种最常用和相关的砷化学物质中，每个样品在不到三分钟的时间内就可以完全分离和精确定量。

该洗脱时间比常规技术（如阴离子交换色谱）在砷形态研究中应用的常规技术快五倍。

这项工作是在没有内部标准的情况下进行的，重现性表明不需要内部标准;然而，如果需要内标，之前的工作已经证明，砷甜菜碱(AsB)可以在三分钟后作为一种合适的内标洗脱。^7.

每次苹果汁样品后的空白分析表明，注射之间没有结转。

图4。色谱图显示未稀释的苹果汁样品以及该样品的低端（2μg/ L）和高端（10μg/ L）尖峰。图像信用：PerkinElmer食品安全和质量

没有携带的缺乏非常有用，特别是在商业实验室中，其中样品之间的限制漂洗可降低溶剂使用，产生更高的生产率和较低的开销。

为了评估苹果汁基质对分析精度的影响，将每种砷物种的低端（2μg/ L）和高端（10μg/ L）钉引入未稀释的样品。图4说明了与样品相比的2μg/ L和10μg/ L尖峰的色谱图。

图5。与四个商业生产的苹果汁中的v，mma和dma的平均浓度与10μg/ l的动作限制相比，误差栏显示了复制分析的标准偏差（SD）。图像信用：PerkinElmer食品安全和质量

确定尖刺样品对纯样品具有相似的保留时间，并展示了各种砷物种的99-111％（2μg/ L穗：103,111,100,99％回收率和10μg）之间的良好穗状花序回收率。/ L穗：106,103,111和101％恢复为V，MMA，III和DMA）。

这是一个关于跨越线性动态范围的方法的准确性的证词，并且演示了样品可以以直接的方式制备。

图5显示了收集的样本结果。如先前的研究中所确定的，砷的无机形式是主要形式（如III和AS V），其中DMA是最普遍的，MMA仅存在于几个样品中。^6,7.

很明显，每个苹果汁都具有各种浓度的砷的不同化学物质，然而，所有样品的所有样品均为16-34％的无机砷的作用水平^5.因此，低于FDA的毒理学关注阈值。^4.

结论

本研究证明，使用反相离子配对方法有助于在商业上可获得的苹果汁中的完全分离和精确定量，包括初级有毒形式（如III和AS V），在不到三个分钟。

这项工作是利用aNexsar HPLC-ICP-MS形态分析准备解决方案，其中浓度留在μg/ l和ng / l范围内。

本研究中评估的所有苹果汁样品中的无机浓度低于FDA推荐的约10μg/升的动作限值。^4.

通过可重复性，携带和尖峰恢复研究表现出建议方法的力量与硬件的可靠性和强度相结合。

NexSAR泵和自动取样器的惰性流体路径，以及泵的密封后清洗，让人放心，样品有可能在低pH(本研究中的pH值为4.0)下常规运行。这是与盐缓冲，没有风险的腐蚀和实质性的密封损害。

参考文献

1. Gerhauser C. 2008.苹果，苹果汁和苹果组件的癌症化学预防潜力，纽约：Planta Medica Doi：10.1055 / s-0028-1088300。
2. 王志强，王志强，王志强。2012。苹果汁中的砷和铅:苹果、柑橘和苹果基，环境健康杂志，75:14-21。
3. de Burbure C, Buchet JP, Leroyer A, Nisse C, Haguenoer JM, Mutti A, Smerhovsky Z, Cikrt M, Trzcinka-Ochocka M, Razniewska G, Jakubowski M, Bernard A. 2006。镉、铅、汞和砷对儿童肾脏和神经系统的影响:环境暴露水平的早期影响和多重交互作用的证据，环境健康展望，114:
4. FDA。2013年。在苹果汁中支持砷的行动水平的文件。FDA-2012-D-0322。
5. Bhattacharya P，Welch Ah，Stollenwerk Kg，McLaughlin MJ，Bundschuh J. 2007.砷在环境中：生物学和化学，科学，总环境科学，379：109-120。欧洲杯线上买球
6. Neubauer K，Perrone P，Reuter W. 2012。HPLC / ICP-MS的苹果汁中砷形式的测定。PerkinElmer应用笔记。
7. Ernstberger H，Neubauer K. 2015. PerkinElmer应用笔记的准确和快速测定苹果汁中的砷形态。
8. Ernstberger H, Neubauer K. 2015。HPLC, ICP/MS检测苹果汁中的砷:使用离子对色谱和阳离子对试剂，可以更快的运行时间和更低的检测能力分析苹果汁中的砷。色谱技术,p10。
9. 海特兰P，KösterHD。2008. HPLC-ICP-MS的尿液中砷物种和砷的快速测定：未暴露德国居民和临床案例研究的浓度范围。分析毒理学杂志32：308-314。
10. 液相色谱问题的解决和故障排除。1994。色谱科学杂志32:524欧洲杯线上买球https://doi.org/10.1093/ ChromSCI / 32.11.524

使用的消耗品

表3。资料来源:PerkinElmer食品安全和质量公司

组件	描述	零件号
反相 列	4.6 mm i.d x 250 mm，5μm	N8145326
高效液相色谱瓶	HPLC测试塑料小瓶，1.5mL PP	N9301736
PEEK油管	黄色，0.007 " ID, 1/16 " OD(5英尺)	N9302678
PEEK配件	用于1/16 " OD PEEK油管	09920513.
喷雾器 连接器	柱 - 玻璃同心雾化器连接器	N8152484

这些信息来源于PerkinElmer食品安全和质量公司提供的材料。欧洲杯足球竞彩

有关此来源的更多信息，请访问PerkinElmer食品安全和质量。