婴儿配方奶粉中维生素b的高效色谱分析

水溶性维生素（WSV）主要由维生素B复合物组成，是许多食物中的关键成分，尤其是婴儿配方。这些维生素在代谢途径中具有关键作用，因此，在引入我们的日常饮食时，继电器在中继相当的健康益处。

由于独立的测试实验室、食品和药物管理局(FDA)和食品和补充剂制造商制定了与这些维生素相关的每日营养建议，因此定量验证这些产品中维生素含量的能力至关重要。

在评估强化食品时，这尤其具有挑战性，因为维生素浓度的变化范围是可变的，同时还要保持每日的摄入量(见表1)。

表1。每种分析维生素的日需要量(DV)。资料来源:PerkinElmer食品安全和质量公司

维他命 DV（每日所需值；镁；根据FDA指南1）
B3(烟酸) 20
B6 2
B3 *(烟酰胺) 无法使用的
B1 1．5
B9 0.4
B7 0.3
B12 0.006
B2 1．7

例如，在婴儿牛奶中，维生素B12（氰基胺）以1-2ppb存在，而维生素B2（核黄素）浓度高出1000倍（1-2ppm）。因此，任何定量分析程序必须具有适应浓度的这种巨大方差的能力。

这里，提出了一种LC-MS/MS方法，用于一次运行中B族维生素的定量分析。所分析的维生素包括维生素B1（硫胺素）、B2（核黄素）、B3（烟酸）、B3*（烟酰胺）、B6（吡哆醇）、B7（生物素）、B9（叶酸）和维生素B12（氰钴胺），使用三种内标物。

采用碱性液体萃取法从婴儿配方奶粉中提取维生素。样品提取与快速分析方法配对(<6分钟)被认为是可靠的，稳健的和最少的时间。

实验

硬件/软件

一个PerkinElmer阿尔特斯™UPLC®系统掺入ALTU A-30溶剂/样品模块，集成真空脱气剂和柱加热器用于色谱分离。对于检测，使用PerkinElmer QSight™210 / MS检测器。使用简单的3Q™软件平台进行仪器管理，分析和数据处理。

方法参数

LC和MS/MS方法参数分别如表2和表3所示。

表2。LC方法参数。资料来源:PerkinElmer食品安全和质量公司

． ．
柱子 PerkinElmer Altus Uplc.®BEH C18，1.7μm，2.1 x 50-mm（零件＃n2972000）
流动相 溶剂A：5毫米甲酸铵，pH至4.9与甲酸
溶剂B:乙腈（ACN）
时间（分钟） 流速（ml / min） %的 % B 曲线
1 最初的 0.5 100.0 0
2 1.60 0.5 100.0 0 6
3. 4.50 0.5 70 30.0 6
4 5 0.5 50.0 50.0 6
5 6 0.5 50.0 50.0 6
6 6.05 0.5 100.0 0 6
分析时间 6分钟;再平衡时间:4分钟
压力 6900 psi/460 bar（最大值）
烤箱温度。 40ºC
注射体积 3µL

表3。MS/MS参数。资料来源：PerkinElmer食品安全和质量

． ． ． ． ． ．
电离模式: ESI-阳性
干燥气体（氮气） 75. HSID临时 320°C; 电喷射V1 5000伏

擅长。组1
（0.20 - 0.85分钟）		 MRM转换（amu）
量词
离子		 限定符
离子		 电动汽车 CE（v） 保压时间
（MSEC）
B3(烟酸) 124.3 / 80.2. 124.3/53.2 55 -30 100

擅长。组2
(0.7 - 2.5分钟)		 MRM转换（amu）
量词
离子		 限定符
离子		 电动汽车 CE（v） 保压时间
（MSEC）
B1（硫胺素） 265.0/121.7 265.0/144.0 20 -25 50
B1'（硫胺素;13C4C8H17N4操作系统+） 269.0/122.0 20 -25 50
B3 *(烟酰胺) 123.3/80.2 123.3/53.2 25 -30 50
B6（吡哆醇） 170.3/133.7 170.3/105.8 22 -28 50

擅长。组3
（3.0-4.4分钟）		 MRM转换（amu）
量词
离子		 限定符
离子		 电动汽车 CE（v） 保压时间
（MSEC）
B7（生物素） 245.0 / 96.4 245.0/104.5 24 -45 35
b7'（生物素; c10D2H14N2O3.（S） 247.0/98.7 24 -45 35
B9（叶酸） 442.1/295.2 442.1/176.0 21 -22 35
B12(维生素B12): 678.9 / 147.2 678.9 / 399.2 23 -45 35
B2（核黄素） 377.0 / 172.3. 377.0/198.2 35 -48 35
B2’（核黄素；13C4C13H2015N2N2O6） 383.0/175.4 35 -48 35

EV =入口电压;CE(V) =碰撞能

溶剂、标准和样品制备

使用HPLC级溶剂，试剂和稀释剂并通过0.22μm尼龙过滤器过滤。对于所有稀释液，使用5mM甲酸铵，用10％甲酸改性至pH4.9。

所有b -维生素标准品，包括B1(硫胺素)、B2(核黄素)、B3(烟酸)、B3*(烟酰胺)、B6(吡多辛)、B7(生物素)、B9(叶酸)和B12(氰钴胺)均购自Sigma-Aldrich®公司,密苏里州的圣路易。

三种内部标准用于校准和定量目的：维生素B1'（硫胺素;13C4C8H17N4操作系统+)，B7'（生物素；C10D2H14N2O3.S） 核黄素；13C4C13H2015N2N2O6），都是从Sigma-Aldrich获得的®公司。

B1'用于校准B3、B3*、B6和B1，而B2'用于校准B2。B7'用于B7、B9和B12。分析的样本包括两种商用婴儿配方奶粉，分别标有IF1和IF2。

为防止可能的标准或样品不稳定，所有库存和工作标准在使用前均保存在冷藏装置中;所有准备的样品都在4小时内进行评估，只使用琥珀色的2毫升LC小瓶。所有校准物和样品均采用0.22微米尼龙过滤器过滤。

实验

标准制备

制备了40 μ g/mL的标准液B2 B9 B7在250毫升容量瓶中完成。由于这三种维生素在碱性条件下溶解效果最好，因此50毫升0.05%氢氧化铵（NH4OH)加入烧瓶中，然后摇匀，直到标准品完全溶解。

然后将稀释剂灌满烧瓶到指定的标记处。用直接稀释剂制备40µg/mL的B3、B3*、B6和B1原液和5µg/mL的B12原液。

将三种原液各25毫升加25毫升稀释剂加到100毫升的容量瓶中，作为工作标准。在摇动过程之后，烧瓶被放入冰箱储存。

该工作标准还用作Level-6校准剂，包括10μg/ ml的每种维生素，除B12外，为1.50μg/ ml。

通过添加每种同位素维生素标准的完整内容物制备内标储备溶液（ISTD），如下所示：将2mg B1'，5mg B7'和1mg B2'分别通入20ml，250ml和10ml容量瓶中。

为了支持溶解，B1'和B2'标准品最初通过1 mL 0.05%NH的5次冲洗转移到每个烧瓶中4哦。将稀释剂倒入三个烧瓶中，并将其填满。B1′和B2′的固液浓度为100µg/mL, B7′为20µg/mL。

通过连续稀释工作标准制定了六个校准水平。产生的维生素浓度如表4所示。

表4。每个校准水平的维生素B浓度。资料来源：PerkinElmer食品安全和质量

校准水平 浓缩的。乘以(B1, B3, B3)
B6、B7、B9、B2(µg/mL)		 浓缩的。的B12
（微克/毫升）
1 0.004 0.0005.
2 ０．０２ 0.0025.
3. ０．１０ 0.0125
4 ０．４０ 0.050
5 2．00 0.250
6 10.00 * * 1.250

** B1、B3、B6和B9不使用6级。

维生素B12的标准浓度范围要低得多，因为它的日摄食量标准要低得多(0.006 mg)。在运行每批之前，将每个校准水平的50 mL倒到一个50 mL的容量瓶中，然后通过添加50µL的ISTD B1 '和B2 '和250µL的ISTD B7 '添加到0.1µg/mL的内部标准。

注：如果任何calibrant液位小于50 mL，则应按比例将ISTD添加到可用体积中。所有Calibrant均一式三份注射。

样品制备

两种婴儿配方奶粉(标记为if1和IF2)的制备，首先将每一种奶粉的必要量称量到50毫升的胶粉离心管中，然后加入20毫升稀释剂。所需的量是根据每个产品的标签声明上公布的粉剂与水的推荐比例确定的。

离心15分钟后，将溶液加入内标0.2µg/mL，加入40µL的ISTD B1 '和B2 '和200µL的ISTD B7 '。

为了补偿以下样品制备过程中的2倍稀释，将样品添加至0.2µg/mL ISTD。然后将20 mL乙腈（用10µL 10%甲酸酸化）引入每个试管中。

随后，在7800转/分钟的转速下进行5分钟的脉冲旋转和离心10分钟。

酸化的ACN导致蛋白质崩溃/沉淀，使用户可以通过离心去除脂肪/固体物质。然后将10.0 mL上清液从三个试管中的每一个小心地转移到单个50 mL离心试管中，并干燥至约1 mL。

在每根试管中注入稀释液至10 mL标记，然后脉冲涡流3分钟，最后以7800 rpm离心5分钟。将1ml上清液过滤到2ml小瓶中。所有样品一式三份注射。

结果与讨论

利用规定的方法参数，图1显示了12级校准器的复合量化器MRM的12重复的叠加层。所有八个维生素都溶解良好，在四分钟内洗脱，12-重复叠层表现出出色的色谱再现性。

对5级校准剂的组合量词mrm进行12次重复叠加。

图1所示。对5级校准剂的组合量词mrm进行12次重复叠加。图片来源:PerkinElmer食品安全和质量公司

图2显示了维生素B1和B12的校准结果的示例，证明了优异的拟合（R2 =≥0.999; n = 3）。对于维生素B2，B3 *，B7和B12，使用6级校准。相反，5级校准用于维生素B1，B3，B6和B9。

维生素B1 (a)和B12 (b)的校准结果;

图2。维生素B1 (a)和B12 (b)的校准结果;每层N = 3。图片来源:PerkinElmer食品安全和质量公司

所有八种维生素的校准拟合度均>0.996。在三次注射6级calibrant后立即注射稀释空白后，未发现八种维生素中任何一种的可检测携带物。维生素B1和B12的携带试验结果示例如图3所示

维生素B1和B12的MRM转移试验:6级校准剂重复注射3次，空白稀释剂。

图3。维生素B1和B12的MRM转移试验:6级校准剂重复注射3次，空白稀释剂。图片来源:PerkinElmer食品安全和质量公司

图4显示了每种分析物最低可定量水平的量词MRMs。维生素B1、B2、B3*和B6均可测量至0.004µg/ml（4 ppb），维生素B12可测量至0.0005µg/ml（0.5 ppb）。

量化MRMs的最低定量水平的每一种维生素。

图4。八种维生素中每种的最低定量水平的量词MRMs。图片来源：PerkinElmer食品安全与质量

维生素B3和B9可测量至0.02µg/ml（20 ppb）。所有分析的维生素均在FDA规定的预期指南范围内可测量。维生素B1、B6和B2的可定量限值（LOQ或IDL）可能要低得多。

研究人员对两种市售婴儿配方奶粉IF1和IF2中的8种维生素b进行了分析。每个样品的制备方法如上所述，每三次注射一次。

图5-6显示了在制备的婴儿配方样品中观察到的每种维生素的单个量化器MRM。两个样品曲线似乎是相似的，这是预期的，考虑到这种类型的产品，标签声称通常是相似的。

IF1中8种b族维生素的量化MRMs。

图5。IF1中8种b族维生素的量化MRMs。图片来源:PerkinElmer食品安全和质量公司

IF2中8种b族维生素的量化MRMs。

图6。IF2中8种b族维生素的量化MRMs。图片来源:PerkinElmer食品安全和质量公司

样品再现性如图7所示，证明IF2中的维生素B2和B12的复制MRM。在1-2 ppb水平的维生素B12水平上的再现性特别令人印象深刻。

IF2中的维生素B2（A）和B12（B）的复制量化器MRM。

图7。IF2中的维生素B2（A）和B12（B）的复制量化器MRM。图片来源:PerkinElmer食品安全和质量公司

如表5所示，除维生素B1in IF1外，计算出的b -维生素浓度均在两种婴儿配方奶粉标签声称的适当目标范围内。B3(烟酸)和B3*(烟酰胺)的具体标签声明值没有被观察到，因为这两种维生素通常被合并并归类于“B3”或仅仅“烟酸”。

表5。与标签声明相比，IF1和IF2中发现的b族维生素的定量结果;n = 3。资料来源:PerkinElmer食品安全和质量公司

维他命 室温（分钟） 如果1 如果2
浓度。每标签声明（微克/毫升） 实际样品浓度。**(微克/毫升） 标签索赔的差异（±％） 浓度。每标签声明（微克/毫升） 实际样品浓度。**(微克/毫升） 标签索赔的差异（±％）
B3 0.457 NA 0.020 -- NA 0.029 --
B6 0.904 0.450 0.42 - 6.7 0.405 0.30 - 25.9
B3* 1.097 NA 2.56 -- NA 2．35 --
B1 1.305 １．５０ 0．80 - 47. 0.643 0.70 + 8.9
B9 3.180 0.195 0．17 - 12.8 0.103 ０．１３ + 20.1
B7 3.540 0.038 0.040 + 5.3 0.030 0.033 + 10.0
B12 3.814 0．002 0．002 0 0．002 0．002 0
B2 3.954 １．５０ 1.61 + 7.3 1.029 0.98 - 4.8

** 3次重复的平均值

这两种维生素被认可为其互换的能力，使得可定量的比较困难。2IF1中维生素B1的低值可能是真实的，因为IF2的值接近标签上的声称，即使是高值，也表明了良好的维生素B1恢复预期。

总的来说，结果支持良好的回收率符合所提供的样品制备程序的婴儿配方奶粉。为了提供额外的分析物确认，也建立了限定符/量词离子比率。

如表6所示，两种婴儿配方奶粉中发现的可定量维生素的离子比值均被认为在标准确定的离子比值的耐受窗(±20%)内。烟酸(B3)浓度太低，无法按比例计算，因为任何被鉴定出的维生素B3主要是烟酸酰胺(B3*)。

表6。IF1的分析物离子比和相应的标准水平。资料来源:PerkinElmer食品安全和质量公司

维他命 用于离子比(amu)的MRMs 离子比例 ％差异（±）
如果1 标准
B3* 123.3/53.2
123.3/80.2		 0.165 0.158 + 4.4
B6 170.3/105.8
170.3/133.7		 0.046 0.045 + 2.2
B1 265.0/144.0
265.0/121.7		 0.241 0.241 0
B9 442.1/176.0
442.1/295.2		 0.473 0.478 - 1.0
B7 245.0/104.5
245.0 / 96.4		 0.692 0.752 - 7.8
B12 678.9 / 399.2
678.9 / 147.2		 0.773 0.642 + 20
B2 377.0/198.2
377.0 / 172.3.		 0.802 0.773 + 3.8

结论

所取得的成果，验证了LC-MS/MS法用于婴幼儿配方婴儿B-维生素的有效，常规和鲁棒色谱评价。

这是使用单个MS方法实现的，以在不到4分钟的范围内在广泛的浓度范围内建立和测量八种水溶性维生素。结果表明了优异的保留时间可重复性，该方法的能力检测维生素B12在0.5ppb下，远低于婴儿配方中的预期水平〜2 ppb。

参考

  1. 美国食品和药物管理局（FDA），行业指导：食品标签指南（14.附录F），http://www.fda.gov/food/guidanceregulation/guidancedocomenstregulatoryInformation/labelingnutrition/ucm064928.htm
  2. Nick Byrd，Campden Bri，英国

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引用

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  • APA

    PerkinElmer食品安全和质量。（2021年，8月11日）。婴儿配方婴幼儿B-维生素的鲁棒色谱分析。Azom。从Https://www.wireless-io.com/article.aspx?articled=20648从//www.wireless-io.com/106。

  • MLA

    PerkinElmer食品安全和质量。《婴儿配方奶粉中维生素b的高效色谱分析》。氮杂．2021年9月06。< //www.wireless-io.com/article.aspx?ArticleID=20648 >。

  • 芝加哥

    PerkinElmer食品安全和质量。《婴儿配方奶粉中维生素b的高效色谱分析》。Azom。//www.wireless-io.com/article.aspx?articleId=20648。（访问于2021年9月6日）。

  • 哈佛大学

    PerkinElmer食品安全和质量。2021。婴儿配方奶粉中维生素b的高效色谱分析．viewed September 21, //www.wireless-io.com/article.aspx?ArticleID=20648。

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