异黄酮是一种天然存在的水溶性化合物，几乎完全由豆科植物家族的成员产生。
异黄酮来源于多种植物和食物来源，以多种形式存在，包括苷元(大豆苷元、甘氨酸和染料木素)、苷元(大豆苷元、染料木素和甘氨酸)及其乙酰基和丙二酰缀合物。
异黄酮的糖苷酮物种是生物活性的，而葡萄糖苷和缀合物通过细菌β-葡糖苷酶在肠中进行水解，释放相应的糖基。图1显示了三种糖蜜的结构，以及它们的等同葡糖苷。
图1所示。分析了异黄酮的化学结构。图片来源:PerkinElmer食品安全和质量公司
异黄酮在结构上类似于女性激素雌激素，被归类为植物雌激素，通过身体积极结合雌激素受体。
虽然植物雌激素的雌激素效应通常比天然雌激素的雌激素效果较弱，但结果可以对人体具有正面和负面影响。
植物雌激素已经证明了减少许多癌症的发育潜力的能力（例如乳腺，子宫内膜和前列腺癌），抑制骨质疏松症的发作并提高LDL与HDL胆固醇的比例。1-4
然而，研究也认为，植物雌激素的内分泌干扰特性可以加剧现有的甲状腺疾病。5
如今，市场上有广泛的异黄酮补充剂，其中许多是营养保健品。因此，为了保护人类健康并确保补充剂中包含治疗活性成分的治疗水平，确认标签索赔精度对于开发和制造营养制品至关重要。
美国药典(USP)和官方农业化学家协会(AOAC)都已经通过高效液相色谱(HPLC)确定了评价各种补充剂中异黄酮的方法。6 - 8
然而，这些分析方法对高通量实验室是不可行的，并导致大量溶剂的消耗。
尽管存在几种异黄酮的分析方法，但该项目的目的是推进更简单，更快，更可靠的液相色谱法，用于评估大豆营养素补充中最常用的异黄酮。提供方法条件，其包括性能数据，例如线性度和可重复性。
实验
硬件和软件
色谱分离是利用PerkinElmer LC 300 UHPLC系统包括LC 300 18K PSI UHPLC泵，LC 300 UHPLC自动进样器，具有温度控制的样品隔室和内柱烤箱。
通过LC 300光电二极管阵列检测器（PDA）完成检测。使用SimpleCity™RHOB CDS软件平台进行仪器控制，分析和数据处理。
方法参数
LC参数描述于表1中。
表格1。LC参数。资料来源:PerkinElmer食品安全和质量公司
| ． |
． |
| 柱子 |
PerkinElmer Brownlee SPP C18，2.7μm，75 x 2.1 mm（零件＃n9308403） |
| 流动相 |
溶剂:HPLC或LC/MS级水，含0.1%甲酸
溶剂B：HPLC或LC / MS级乙腈，具有0.1％甲酸
溶剂计划:线性渐变
| 一步 |
时间
(最小值)。 |
流量
（ml / min。） |
%的 |
% B |
| 1 |
0．00 |
0.600 |
88. |
12 |
| 2 |
０．１０ |
0.600 |
88. |
12 |
| 3. |
6．00 |
0.600 |
70 |
30. |
| 4 |
6.99. |
0.600 |
70 |
30. |
| 5 |
7.00 |
0.600 |
88. |
12 |
|
| 分析时间 |
7.0分钟。 |
| 平衡时间 |
2.0分钟。 |
| 压力 |
~5500 psi/380 bar最大 |
| 烤箱温度。 |
30ºC. |
| 样品温度 |
环境 |
| 注射卷。 |
5µL |
| 检测波长 |
260 nm带宽15 nm参考波长:400带宽40 nm |
| 数据收集率 |
5分/秒(赫兹) |
溶剂和标准制剂
所用溶剂和稀释剂均为HPLC或LC/MS级。三个苷元和三个葡萄糖苷标准品均来自Sigma-Aldrich®公司(St. Louis, MO)的粉末。
这些标准品包括大豆素、大豆素、染料木素、染料木素、甘氨酸和甘氨酸。USP脱脂粉状大豆参考材料也从Sigma-Aldrich获得®，Inc（圣路易斯，MO）。
通过将5-10mg的每种标准物溶解在约400μg/ ml的单一的储备溶液中，通过将5-10mg溶解到乙腈中来完成制备。通过加入各个储备溶液的适当等分试样来制备混合标准溶液，并用水和乙腈稀释到最终体积，使得溶剂为50:50水：乙腈。
用75:25水:乙腈连续稀释混合标准品，进行校准剂的制备。这些标准的最终浓度如下表2所示。
表2。组化合物是Daidzin，Daidzein，Genistin和Genistin。B组化合物是缩水糖蛋白和糖型素。资料来源:PerkinElmer食品安全和质量公司
| 解决方案名称 |
组一个浓缩的。
（μg/ ml） |
B组CENC。
（μg/ ml） |
| STD-A |
10.00 |
5.000 |
| STD-B |
5.000 |
2.500 |
| STD-C |
2.500 |
1.250 |
| STD-D |
1.250 |
0.6250 |
| STD-E |
0.6250 |
0.3125 |
| STD-F |
0.3125 |
0.1563 |
| STD-G |
0.1563 |
0.07813. |
| STD-H |
0.07813. |
0.03906 |
USP脱脂粉末大豆参考材料用于制备乙酰基和丙二酰基保留时间检查溶液，如USP Isoflavone胶囊中所述。
在120℃下在开放的容器中加热一份200mg部分，持续2小时。将第二部分的参考材料容易称量为合适的小瓶。两者都制备，包括2ml乙腈和1.2ml水，然后混合1小时。
每个小瓶中加入额外的1.8 mL水，完全混合，离心，并使用0.45 μ m PVDF过滤器过滤。等价物在分析前再以1:1稀释。
样品制备
三种不同的膳食补充剂，包括大豆异黄酮，从当地的健康食品店获得。只包括感兴趣的大豆异黄酮，而另外两个包括一系列补充草药成分。
每一种补品的含量从五种胶囊中汇总并称重。根据标签上的声明量，对混合材料的数量进行称重，以提供大约5毫克的异黄酮。
通过加入10mL乙腈和6mL水，然后混合1小时，制备样品在USP专着中详述。6每个小瓶中加入另外9 mL水，完全混合，离心，使用0.45 μ m PVDF过滤器过滤。在分析前，再用水以1:1进一步稀释。
结果和讨论
的色谱图图2显示了高浓度标准品(Std-A, 10.0/5.0 μg/mL)的浓度。图3为以脱脂大豆粉为对照品的加热样品的色谱图。
图2。10.0/5.0-μg/mL异黄酮的色谱图。图片来源:PerkinElmer食品安全和质量公司
图3。加热USP脱脂大豆粉显示峰鉴定:1)丙二酰大豆苷2)丙二酰大豆苷3)乙酰大豆苷4)乙酰大豆苷5)丙二酰大豆苷6)乙酰大豆苷。图片来源:PerkinElmer食品安全和质量公司
这与未加热的样品一起，被用来确定异黄酮的乙酰基和丙二酰共轭形式的保留时间。这些化合物被认为是不稳定的，而且不容易获得标准品。
由于这些化合物不包括在校准标准中，因此使用USP专题中详述的方法计算量。
等效葡萄糖苷校准曲线用于计算使用校正因子增强的浓度。图4显示了六种复制2.5 / 1.25-μg/ ml异黄酮标准注射的叠加层，显示出优异的再现性。
图4。2.5/1.25-μg/mL异黄酮标准品6个重复的色谱覆盖层。图片来源:PerkinElmer食品安全和质量公司
保留时间重复性小于0.01分钟，所有分析物的峰值面积％RSD小于0.5％。
图5显示了所有六种异黄酮化合物在测试浓度范围内的校准结果。所有六种化合物均表现出良好的线性(一阶)拟合，并具有R2系数大于0.999。
图5。三种糖苷和三种苷元异黄酮的8个水平校准集的结果。图片来源:PerkinElmer食品安全和质量公司
如表3所示，记录每种分析物的检出限(LOD)和定量限(LOQ)，并根据低标准(STD-H, n=6)测量的响应的标准偏差和每种分析物的校准曲线斜率计算。
表3。六个分析物的LOD和LOQs，按洗脱次数。资料来源:PerkinElmer食品安全和质量公司
| 分析物 |
计算LOD
（μg/ ml） |
计算Loq.
（μg/ ml） |
| Daidzin. |
0.0099 |
0.0330 |
| Glycitin |
0.0063 |
0.0209 |
| 萃取精制 |
0.0092 |
0.0306 |
| 达迪辛 |
0.0028 |
0.0095 |
| Glycitein |
0.0062 |
0.0208 |
| Genistein. |
0.0026 |
0.0085 |
样本结果
使用相同的色谱条件，对所制备的三种补充样品进行分析。补品A和B的色谱结果在视觉上相似，大部分异黄酮的含量在苷类大豆苷和染料木苷的形状上，如图6所示。
图6。补充剂A和b的代表性色谱图。图片来源:PerkinElmer食品安全和质量
如图7所示，样品C显示测量分析物的不同相对浓度的测量分析物的相对浓度，明显地以较高的乙酰基和丙基缀合的葡糖苷。
图7。补品C的代表性色谱图。图片来源:PerkinElmer食品安全和质量公司
三种胶囊样品的定量结果如下表4所示。样品A和B在色谱和定量上显示了相似的轮廓。
两种产品由相同的制造商制造和细节相同的成分源。样品C由不同的制造商制造，并列出了不同的成分来源。
表4。检测三个样品中异黄酮的浓度。资料来源:PerkinElmer食品安全和质量公司
| 分析物 |
样本A.
（μg/ ml） |
样品B.
（μg/ ml） |
样品C.
（μg/ ml） |
| Daidzin. |
76.6A |
67.9 |
84.8 |
| Glycitin |
10.3 |
14.4 |
47.3A |
| 萃取精制 |
106A |
105A |
25.0a. |
| 丙二酰黄豆苷 |
0.364 |
0.378 |
18.1 |
| 丙酰缩水糖蛋白 |
0.156 |
0.134 |
8.04 |
| 乙酰·德齐汀 |
4.74 |
4．10 |
7.51 |
| 乙酰Glycitin |
0.520 |
0.723 |
3.23 |
| Malonyl Genistin |
n |
n |
4.98 |
| 达迪辛 |
0.941 |
0.887 |
3.794 |
| Glycitein |
0.351 |
0.512 |
1.74 |
| 乙酰基萃取精制 |
7.45 |
6.39 |
1.64 |
| Genistein. |
0.540 |
0.481 |
0.637 |
| 总异黄酮 |
208. |
201. |
207. |
| 异黄酮标签索赔(每重量) |
202(26.1毫克) |
203（43.3毫克） |
202（189.5毫克） |
| 标签索赔百分比 |
103% |
99.1% |
102% |
每个样品中的三种葡糖苷化合物被测量高于高校准标准。因此，基于测试的曲线范围的线性和LC 300 PDA检测器的已知宽线性范围提供外推值。
结论
这项研究揭示了如何PerkinElmer LC 300 18K UHPLC系统具有PDA检测的快速，鲁棒色谱分离和大豆异黄酮的定量，包括葡糖苷，乙酰甘油酯和丙糖苷缀合物。
结果表明了卓越的保留时间可重复性，以及测试的浓度范围内的卓越线性和再现性。
样品按照美国药典(USP)关于膳食补充剂胶囊中大豆异黄酮的各论进行制备，分析结果与每个样品的标签声明一致。
该方法对大多数分析物的定量限≤0.03µg/mL，比三种样品中任何一种分析物的检测限低4倍。
参考
- 莱纳斯鲍林研究所，俄勒冈州立大学微量营养素信息中心。https://lpi.oregonstate.edu/mic/dietaryfactors/phytochemicals/soy-isoflavones。3月2020年3月访问．
- Anderson JW, Johnstone BM, cook - newell ME。大豆蛋白摄入对血脂影响的meta分析。中华医学杂志，1995;33:276-281。
- Baum Ja，Teng H，Erdman JW JR等。长期摄入大豆蛋白质改善了血脂谱，并增加了高胆固醇，绝经后妇女的单核细胞低密度 - 脂蛋白受体信使RNA。AM J Clin Nutr。1998年; 68：545-551。
- 张志强，张志强，张志强，等。植物雌激素染料木素对绝经后骨质减少妇女骨代谢的影响。Ann Intern Med. 2007;146:839-847。
- Sathyapalan, Thozhukat等，“大豆植物雌激素补充对亚临床甲状腺功能减退患者甲状腺状态和心血管风险标志物的影响:一项随机、双盲、交叉研究”临床内分泌学杂志;《新陈代谢》，第96卷，第6期。5, 2011, pp. 1442-1449。, doi: 10.1210 / jc.2010 - 2255。
- USP Inograph Soy Isoflavones胶囊;页面参考USP43-NF38 - 5276;文档ID GUID-683A08A4-E4C7- 4DB4-A080-B97DFF5500C3_1_EN-US。
- 用高效液相色谱法测定膳食补充剂、补充剂成分和大豆食品中大豆异黄酮的含量:合作研究。J AOAC Int. 2008;91(3) 489 - 500。2020年3月在线访问。
- Daems，Frederic，分析方法用于量化牛奶中的异黄酮：审查。乳房SCI。＆Technol。2016 96：261-283。
此信息已采购，从PerkinElmer食品安全和质量提供的材料进行审核和调整。欧洲杯足球竞彩
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