扫描电子显微镜使用电子束而不是光束，使我们能够看到低于传统光学显微镜衍射极限的纳米级图像结构。
然而，电子显微镜的重要警告是样品必须暴露于恶劣的条件。
虽然光很容易通过空气传播，但电子却不能。因此，为了使用扫描电子显微镜(SEM)，它必须暴露在硬真空中。
此外，考虑到成像依赖于显微镜和样品之间的电子转移，如果不先将非导电样品涂覆在导电层中，则对其成像可能很复杂，甚至不可能。
虽然SEM样品制备可能很复杂，但正确和仔细地进行是至关重要的，以创建有意义和详细的图像。本指南提供了SEM样品制备的实用大纲，范围从样品收集到成像点。
收集样本
扫描电镜成像的第一步，实际上是所有类型的显微镜，是进行样品收集。
这里有一些典型的规则。当然，有必要确保所选样本代表相关表面、散装材料或总体。
鼓励在样品采集前后拍照，以确保记录样品在自然状态下的外观。
样品收集的另一个重要方面涉及用于运输和储存样品的容器;它们的选择和处理方式必须保证样品不受损害。
样品准备被称为“清洁”过程，简单地说，这意味着从样品收集开始的每个阶段都应该戴手套。
确定所需准备的水平
SEM样品制备的两个主要决定因素是样品的水分含量和硬度。
这些元素紧密联系在一起也就不足为奇了:例如，硬样品通常是干的(例如，复合材料或纳米线样品)，欧洲杯足球竞彩1，2而软样品往往含水量较高（例如，细胞培养或生物样品）。3.
脱水和固定
软物质样本，如活细胞、小生物体和组织，在成像前需要固定和脱水。相反，干燥、坚硬的样品不需要太多的处理，而且相对容易成像。
固定是指对样品进行化学处理以保持和稳定其结构的术语。
固定通常通过使用缓冲化学固定剂，如戊二醛、甲醛或单宁酸孵育进行;随后通常使用四氧化锇进行固定。4.跳过这个固定过程将自然导致样品在脱水阶段损坏。
样品固定后可进行漂洗和脱水。如果样品中含有水分，则必须进行脱水:当暴露在显微镜内的高真空条件下时，所有样品必须是无水分的。5.
虽然使用风干或化学脱水是快速的，但它不一定能提供最好的结果。事实上，这样的技术可能会影响样本的完整性，并有损害的风险，特别是在使用HMDS(六甲基二硅氮烷)等化学物质的化学导致的快速脱水情况下。
临界点干燥(CPD)或冷冻干燥通常用于获得高质量的结果-这两种命名的过程都通过绕过突然的液相-气相转变来防止样品损坏。
临界点干燥(也称为超临界干燥)是一种高温、高压的过程，它允许液体平稳地转变为气体，而不经过突然的相边界。6.
液体和气体之间的表面张力，在临界点，是零-因此液体可以从样品中去除而不破坏他们。
在将水放入CPD机器之前，通常先用乙醇或丙酮（通过以一系列浓度增加的溶剂浸泡样品）替换水，因为水在其临界点处温度较高，且不易与液态CO混溶2.．
比较容易使样品干燥并保持其CO的自然外观2.具有较低的临界点(31.0°C)。
冷冻干燥是一个不那么复杂的过程。冻干只需将给定的样品放入冻干机中即可完成。在这台机器里，水首先被冻结，然后从固相升华为气相。
采用冷冻干燥法和CPD法得到不同的结果。虽然CPD被认为对高达5000x放大倍数的样品有效，但在此放大倍数之外，通常可以看到明显的结构损伤。
考虑到液态CO2.是一种强溶剂，一些样品也可能被CPD中涉及的化学物质部分溶解。因此，这就禁止了CPD的使用，因为CPD在CO中是高度溶解的2.．
但是，需要注意的是，冷冻干燥不会导致样品溶解，通常可以使用更高的放大倍数。当然，通常情况下，冷冻干燥会产生崩塌和聚集等分子伪影，可溶元素可以在样品中重新定位。
重要的是，样品在干燥后立即移动到干燥储存，以防止环境湿度的积累。
曝光、清洁和抛光
当涉及到显示成像所需的表面时，有三大类方法。这些措施如下:
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可通过机械作用或电解过程（如电解抛光）执行的操作，如破裂、切割和抛光
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机械稀释或气体传播颗粒磨损
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化学和物理处理等化学变薄，化学抛光，等离子体蚀刻或聚焦离子束（FIB）。等离子体蚀刻和FiB在显微镜本身内原位进行。
像这样的成像方式需要非常光滑的表面能量色散x射线光谱（EDS）-这意味着抛光至关重要。
相反，普通扫描电镜（SEM）不需要抛光，因为它是用来探测形貌的。使用的放大倍数、成像的特征类型以及样品本身的特性决定了使用哪种技术。
氮气鼓风机或鼓风机可以是去除样品灰尘的有效方法。不建议使用“罐装空气”或“空气除尘器”进行SEM制备。这类产品可能会损害样本，因为它们通常含有其他化学物质。
越来越多的
安装样品时，确保短棒和样品顶部之间形成导电接触是关键。因此，如下图所示，当使用粘合剂时，必须使用足够的粘合剂，以使连续涂层能够在样品和短棒之间桥接。
图片来源:Quorum Technologies Ltd
尽管碳纳瓦和碳胶带提供了高达100,000倍的倍率，但它们会产生在SEM环境中产生除气或爬行的风险。由于这些原因，不建议使用它们的使用来进行更高的放大率。采取此预防措施确保防止样品顶部的电荷累积。
通常，对于粉末，使用单用刷子将少量材料施加到一块碳带中足够。一刷通常足够，并且可以使用光学显微镜检查沉积在带上的材料的量。
纳米粒子应欧洲杯猜球平台首先使用适当的溶剂溶解(如乙醇或异丙醇)。建议您使用碳水泥将硅片安装到存根上，然后彻底清洁它。需要3-5微升的溶液液滴来提供良好的样品分散。
涂层
最后，在扫描电镜中拍摄图像之前的最后一个阶段是涂层。通常，现代显微镜制造商声称，由于现代显微镜的电荷补偿机制和低电压，SEM成像不需要涂层。然而，这一建议应该经过仔细审查。
即使在低电压下充电也会降低图像质量，尽管与老型号相比，现代显微镜的充电问题更小。例如，下面的图片显示了极端的充电文物，即使它是在只有1kev的情况下捕获的。
图片来源:Quorum Technologies Ltd
为了确保没有电荷能“逃逸”样品(而不是积累和造成图像失真)，涂层是必不可少的。然而，这只是涂层提供的众多优势之一。
由于金属涂层的存在，信号可以被定位到样品的表面。这提供了关于表面的更详细的信息，同时提高了信噪比，二次电子发射和图像对比度。
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此外，涂层可以降低污染的风险。污染在扫描电镜中有两个方面。首先，它会降低图像质量，其次，它也会逃离样品，导致显微镜本身的损坏。
样品的直接涂层将显微镜污染的风险降至最低，因为它在提高图像质量的同时有效地“密封”了样品。
涂层的另一个有效用途是，由于其局部热，它可以有效地减少光束损伤。在这种情况下，由于金属涂层的导热性确保热量可以从目标位置流出，因此在一个位置可以实现持续观察。
当然，这对于可能被高温损坏或蒸发的敏感生物样品具有特殊的用途。
选择涂层
当涉及到SEM涂层时，有许多不同的合适的材料可供选择，这往往取决于所需的放大倍数。欧洲杯足球竞彩当涂层在相同的条件下，不同的金属有不同的晶粒尺寸——当成像小的特征时，只有小的晶粒尺寸是合适的。
铱、钨或铂是拍摄纳米级物体的关键元素。铬、金和银也适用于较小的放大率。
铬、钯和碳最适合于背散射电子（BSE）成像。如果EDS更好，碳是明显的选择，但是钨和金也是很好的选择。这里的关键步骤是使用一种材料进行涂层，该材料的峰值距离研究所检测的元素很远。
Quorum Technologies的SEM涂层机
当使用SEM进行成像时，Quorum明白适当的样品制备方法会产生所有的差异。法定人数的Q加系列涂层机提供了世界一流的涂料标准，但避免了大型制造商的萎缩成本。
氧化型涡轮分子泵浦涂布器可以氧化和非氧化金属，同时它们的旋转泵浦的低成本溅射涂料适用于非氧化金属。
Q Plus系列可用于SEM、FE-SEM和TEM应用的溅射涂层和蒸发碳涂层。
参考
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- 霍斯,C。植物细胞的电子显微镜．(学术出版社,2012年)。
- Stadtländer, c.t.k - h。电子显微镜下生物组织加工中的脱水和复水问题。微指令。今天13，32-35（2005）。
- Tsotsas，E.＆Mujumdar，A. S.现代干燥技术，卷3:产品质量和配方．（John Wiley＆Sons，2011）。
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