牛奶中植物甾醇的准确分析是很重要的——为了获取营养信息，检测植物甾醇类型，也确保牛奶的纯度。
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植物甾醇是植物衍生的甾醇，具有与胆固醇类似的化学结构。在植物和海洋来源中鉴定出超过250种不同的植物来源，在动物中具有与植物的类似功能。
植物甾醇引起了人们极大的兴趣，因为它们与胆固醇竞争，被吸收到血液中，对健康有益。研究表明，植物甾醇具有化学预防、抗炎、抗氧化、抗癌、抗糖尿病和抗动脉粥样硬化的作用。植物甾醇不是由人体产生的。
由于这些潜在的益处，一些植物甾醇加入补充食物。通常，牛奶和牛奶产品含有植物甾醇。
然而，高植物甾醇饮食可以减少血浆中有益胡萝卜素和维生素D的水平。尽管植物甾醇的无毒性质，过度公报导致副作用如恶心，胃灼热和胃部不适。因此，根据伊朗国家标准化组织指南（2017年），乳制品允许在乳制品中允许不超过3％w / w植物甾醇。
用于植物甾醇分析的一般方法
许多已建立的研究检测和估计植物甾醇。最初，虽然酶和分光光度法被用来分析植物甾醇，由于干扰和缺乏特异性的问题需要有效的方法。
常用的植物甾醇分离鉴定方法是气相色谱-火焰离子化检测器(FID)或质谱联用。与GC-FID相比，GC-MS在定量方面具有优势，因为它可以识别植物甾醇并评价洗脱峰的纯度。
然而，这里的植物甾醇需要处理形成甾醇衍生物，以导致有效的分辨率，鉴定和定量。植物甾醇的衍生化主要是通过硅基化或在催化剂下对羟基进行乙酰化。
虽然衍生化的额外步骤可以提高该方法的灵敏度，但衍生物是不稳定的。因此，为植物甾醇开发了高效液相色谱（HPLC）等方法，其中不需要衍生化。
然而，基于HPLC的直接测定牛奶样品中的植物甾醇是由于干扰的存在导致的挑战。通常，牛奶中的植物甾醇分析从样品中的微萃取开始。
气相色谱用固相微萃取固定器。图片来源:ggw / Shutterstock.com
微萃取是一种样品制备技术，用于提取和预浓缩任何给定样品中存在的分析物，用于分析过程。
植物甾醇分析的不同样品制备方法包括固相微萃取（SPME），超声波辅助乳化，分散液 - 液体微萃取（DLLME），与LLME相结合的分散液，以及空气辅助的LLME。
其中，Assadi和同事于2006年推出的DLLME是一种著名的样品制备方法，基于类似于云点萃取的三元溶剂体系。在这种方法中，将萃取溶剂和分散溶剂用注射器快速注入水溶液中，形成混浊溶液。
分散在水溶剂中的萃取溶剂的微细欧洲杯猜球平台颗粒具有高接触面积，最大限度地使分析物从水样品瞬间分配到萃取相。然后，将混合物离心，收集含有分析物的沉淀萃取溶剂进行分析。
由于其工作体积小，具有高的样品-萃取相体积比，节省时间和成本效益，从而提供足够的富集因子和提取回收率(ER)，并具有较低的检测限(LoD)。DLLME萃取时间为2-10分钟。该技术自动化程度低，投资成本低。
关于这项新研究
最近发表在分离科学杂志欧洲杯线上买球开发了一种从牛奶中提取四种植物甾醇(豆甾醇、β谷甾醇、油菜甾醇和菜薹甾醇)的DLLME方法，然后用HPLC-UV(紫外线)检测。
通过使用两种类型的溶剂-商用有机溶剂(OS)和深共晶溶剂(DESs)来独立研究该方法的效率，这是第一次对该过程中的溶剂进行临界比较的研究。
DESs是新一代对环境无害的高纯度溶剂。本研究发现，有效的DESs溶剂是氯化胆碱:对氯酚，而有机溶剂是四氯化碳。
对该方法进行了验证，并从富集因子(EF)、萃取回收率(ER)、基质效应和溶剂体积等方面比较了两种溶剂的结果。
乙腈(ACN)用于沉淀乳固体，并作为分散溶剂。经DLLME分离后的植物甾醇在高效液相色谱-紫外分光光度法中易于检测。
在DES-DLLME中，5% w/v氯化钠提高了效率，而在OS-DLLME中，盐不起作用。两种方法的提取时间均不影响提取效率，均在0 ~ 120s之间。
两种方法的测定系数均为>/= 0.994。OS-DLLME和DES-DLLME在3 ~ 10000 ng/mL和1 ~ 10000 ng/mL范围内均呈良好的线性关系。OS-DLLME和DES-DLLME的检出限和定量限分别为0.3 ~ 0.9 ng/L和1.0 ~ 3.0 ng/L。
OS-DLLME和DES-DLLME日内、日间精密度的相对标准偏差(RSD)分别为
真实牛奶样品分析
在对真实牛奶样品的分析中，研究人员发现，基于OS-DLLME和des - dllme的方法之间没有显著差异。不同的牛奶样品含有不同的植物甾醇。然而，ISO 23349:2020(使用GC)检测的牛奶样品显示不含植物甾醇。
该方法与其他方法的比较
本研究对植物甾醇测定的LR、LOD、提取时间和RSD进行了详细比较。方法包括液-液萃取- GC-MS (LLE-GC-MS)、dllme注射口衍生化气相色谱- ms、微波辅助衍生-双超声辅助分散液-液微萃取-超性能
食品饮料的米氏离子色谱分析
质/ MS (MWA derivatization-DUSA-DLLME-UPLC-MS / MS),和分散固相extraction-deep低共熔溶剂性凝固漂浮有机drop-liquid-liquid microextraction-GC-MS (DSPE-DES-SFOD-LLME-GC-MS),分析样本-南瓜子油、果汁、牛奶和草药,分别和食用油样本。结果表明，该方法具有较高的灵敏度和效率。
对产业的影响
使用基于DES的DLLME是一种绿色方法，而不使用任何有毒有机溶剂。它可以很容易地由重金属提取行业，食品工业，环境法医学（有机污染物）和其他应用中的元素恢复。欧洲杯线上买球
制药行业可以应用这种方法分析药物、生物毒素、抗生素，以及血液或尿液样本中的生物标记物。食品工业可应用该方法对食品和水样中的农药、杀虫剂、金属离子(如蔬菜中的铜、水中的铅)、咖啡因、染料等进行检测和定量。
通过加快牛奶中植物甾醇的分析速度，这种简单、可靠的方法与以前在不同行业中建立的分离方法相比，可以成为一种合适和潜在的替代方法。
该方法的局限性
本研究详细研究了提取的种类、提取溶剂和分散溶剂的性质、体积、盐和pH的影响以及提取时间，为植物甾醇的分析提供了一个完整的标准化方案。
然而，该方法受到目前最先进设备离心机、高效液相色谱和紫外检测器的需求的限制。此外，该方法并不研究牛奶样本中存在的任何干扰的作用。进一步的研究需要调查该方法在其他食品和饮料中植物甾醇估算的适用性。
结论
本研究建立了一种简便、高效的DLLME法从牛乳样品中提取四种植物甾醇，然后用高效液相色谱法测定。该工作的新颖之处在于分别用有机溶剂和DESs两种溶剂进行微萃取，并比较植物甾醇的提取结果。
两种方法均能成功提取植物甾醇，但该方法的定量限低、线性范围宽、rsd低(精密度好)，且具有较高的EFs和er。该方法是一种快速、灵敏、高效、易于使用的从牛奶样品中提取植物甾醇的方法。
参考资料和进一步阅读：
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