紫外拉曼空间外差光谱仪测量技术作为生物制剂分析

拉曼技术拥有先进的更具挑战性的应用探索,高荧光和低浓度的样品。单克隆抗体和抗体片段类biotherapeutics越来越重要。然而,这些产品都是具有挑战性的和昂贵的制造。

新流程分析工具(PAT)用于监控这些产品在制造过程中重要的利益。深紫外拉曼光谱承诺提供所需的特异性和准确性,然而,乐器,历来是庞大而复杂。在本文中,一个新的深紫外拉曼仪器(奥丁由情报局)是描述使用固体激光器和空间外差光谱仪。仪器克服了实用技术的限制,随时可以用于在线测量。一系列的观察了生物制药产品,包括免疫球蛋白和抗体领域,高水平的特异性和准确性都有了。

拉曼光谱测量技术显示了巨大的希望在应用生物制剂生产。方法非侵入性,理论上可以用来衡量任何分子化合物而提供高特异性和敏感性数据,以及获得纯度和浓度信息。

由于弱目标样品的散射截面,拉曼观察这些产品都是特别具有挑战性的低浓度(毫克/毫升)。此外,很多复杂的生物物质表现出极强的荧光反应,通常掩盖了喇曼签名。

一些研究人员深入调查紫外共振拉曼光谱(UVRRS)作为一个潜在的方法来监测生物制药产品的制造。^1、2、3样本可以详细分析了因为在< 250纳米操作,目标拉曼光谱和荧光响应成为幽灵似地分开。

此外,随着激光的波长低于250纳米,这方法众多有机分子的电子跃迁产生共振效应,可以通过几个数量级的增强拉曼信号。^{4、5、6所示}

目前高性能的远紫外线仪器利用气体泵浦激光器,^4、5这需要水冷和氮清除。另一种方法是使用一个CuNe激光在火星的毅力的使命。⁷

这些激光器不需要冷却和比较紧凑。然而,这些系统在他们的应用程序是有限的能力强烈散射或高度集中的样本是伪脉冲工具净功率为0.04兆瓦。

这些工具通常配高性能色散分光计和CCD冷却。光谱仪通常是敏感的环境意义实现高质量的拉曼光谱的分辨率激光波长低于250海里,通常需要定期调整。

这可能导致仪器需要一个更大的物理足迹时比在长波段操作。^1、2光谱仪通常会利用25µm(或更少)缝,确保光谱是好看。

确保光收集这样的安排达到最大峰值,激光点在目标应保持低于狭缝宽度,这也是导致暴露目标样本功率密度大,结合光子能量较高时,会导致样品损失。^7、8

防止这种风险,样本通常是重新定位的整个持续时间的测量来减轻任何长期接触任何一个地区的目标样本,从而使成功的捕获的拉曼光谱。

到目前为止,这些挑战的采用有限深紫外拉曼仪器学术实验室和非常具体的研究应用,如火星探索任务。

面对这些问题,作者已经准备一个新的紧凑深紫外拉曼仪器,利用二极管泵浦激光空间外差光谱仪(合成),⁹再加上反光拉曼探针集合。

相对紧凑的形式维护由于二极管激光器,也收益出色的稳定性和性能特征。合成促进大型光学吞吐量,导致比较大激光点目标,从而防止功率密度感应样品损失。

仪器已经证明成功捕获的一系列生化样品的拉曼光谱,如免疫球蛋白G(免疫球蛋白),色氨酸和一系列域抗体(dAb)样本。

scFv抗体片段(例如,工厂,轻拍,等等)也逐渐成为一个重要的蛋白质biotherapeutics类。

由于其较小的规模和结构,抗体片段有有益的属性(例如,容易组织渗透),容纳各种诊断和治疗的应用。这些产品通常是昂贵的,任何系统可以提供感兴趣的数据来提高产量。

民建联样本提取在飞行员生物反应器制造过程的不同阶段,以不同的浓度。作者的知识,这是第一次这样的观察。

仪器发展

的CAD图像仪(删除附件)如图1所示。

系统由(a)生产的二极管激光器TOPTICA光子学,空间外差光谱仪(b)和(c)的光学反射拉曼探针集合接口示例中,由IS-Instruments制造。主要仪器的形式为75×45×35厘米和接口用光纤光谱仪。

图1所示。全系统的CAD图像:(a) TOPTICA激光头,ISI他光谱仪(b)和(c)后向散射拉曼探针集合。图片来源:IS-Instruments有限公司

激光

TOPTICA光子学发展一个新的深紫外激光系统、操作为228.5 nm(图1 b),重要的是不需要水冷或内部气体的排除,大大简化操作。这个激光源基于二极管抽运固体激光器(全固态)技术,并优化了一个紧凑的足迹。

全固态泵浦激光器用作低噪声,提供一个输出功率200 mW的基本波长457 nm。这是变频的远紫外线使用方法二次谐波产生(宋惠乔)。

所需的输出功率> 10兆瓦的紫外线通过合并宋惠乔过程和光学增强腔,使转换效率大于13%,最大紫外功率20 mW。

光学组件用于紫外激光阶段,特别是非线性晶体,易UV-induced退化。因此整个紫外线室密封来保证稳定运行在目标部署环境。

进一步加强一生,紫外线室装有一个光学移相器,可以把非线性晶体腔内(没有手动对齐),并提供一些操作晶体表面的斑点。测量现场寿命大于1000小时,一生的紫外激光满足行业需求> 10000小时。

此外,紫外线光束整形光学透镜系统密封室的一部分。这个系统是由镜片紫外线光束集中到一个光学狭缝,在离开光束剖面的抑制诱导功能,带来一个输出光束质量M²< 1.3。

这束剖面担保一个光学清洁的形象和小集中在目标样本。利用两个额外的镜头,输出光束集中,以便从激光焦点位置是0.7孔和1 / e²光束直径大约是200μm。

与这些光束参数,不需要外部的镜头和样品拉曼测量的仪器。

样品界面

作为显示在图2中,拉曼探针集合是一个反映设备,激光是针对样本通过把镜子引导光对样本。样品位置用红色箭头在图2所示。

图2。CAD工具的形象——样品界面。红色箭头表示样品的位置。图片来源:IS-Instruments有限公司

也显示是动态定位阶段的样本是固定的。这使得扫描常规拉曼测量时间的长短,也确保样品不受激光照射时间延长,一个函数,提出了实验部分中详细描述。

背散射光拉曼是获得使用12.5毫米焦距f1:1镜子。然后引导光线通过一个229 nm长通滤波器抑制无关的激光在50 mm焦距镜子25毫米直径聚焦了直径为0.91毫米的光纤维集合。

然后光纤耦合到光光谱仪光谱信息的提取。

谱仪

空间外差光谱仪的配置如图3所示。设计适合运行在深紫外、功率密度、分辨率和稳定性需求受到极端的严密性。

图3。空间外差光谱仪UVRRS所使用的设计工具。图片来源:IS-Instruments有限公司

首先由哈兰et al .(1992),这个设计是关于调查扩散天体。许多团队喇曼自适应设计一系列激发波长的观察。^{11、12、13所示}

仪器图片一个干涉图,必须经过傅里叶变换提取光谱信息,因此,被归类为一个静态傅里叶变换光谱仪。

设计提供了大量的优势;它提供了一个相当大的展度在分散系统中获益。这允许增加现货在目标样本,这减少了功率密度而失去没有光。

与温和的光栅干涉仪配置促进高分辨率采集线密度没有需要增加仪器的足迹。设计自然稳定波长空间,限制定期调整仪器的必要性。

光谱仪是纤维附着在拉曼探针直径0.91毫米0.22 NA光纤。谱仪不需要缝,从而消除了一种常见的光学损失来源。仪器利用光栅400线/毫米,边缘模式是通过三合紫外线透镜成像畸变降到最低。

使用冷却和或iDUS CCD相机,边缘模式随后成像——探测器possesses1024 26µm距×256像素。

此前,Lamsal¹⁴表现出一个紫外线合成仪器利用分割板分束器,以减少任何失真由于板平面度。然而,这种扩张光栅和其他光学元素之间的距离,它放大任何运动光栅板由于环境条件。

因此,特制的立方分光镜是捏造的平坦λ/ 10 228.5海里。这导致有限阶段扭曲与整体光学仪器内部的平面比λ/ 4。

实验

展品的光谱仪校准使用环己烷一系列离散的山峰从801厘米¹到1444厘米¹如图4所示。环己烷光谱总是获得确认仪器保持稳定。

图4。拉曼光谱的环己烷在1 s捕获。图片来源:IS-Instruments有限公司

操作在深紫外、目标样本可以承受很高的辐射能量。这可能会导致损失,降低光谱获得目标材料降解,可能损坏。

免疫球蛋白g的一个评价,这是容易受到紫外线退化,是理解这一效应进行的。获取此数据使用30秒集成乘以,平均10帧被用来产生光谱。

免疫球蛋白光谱收购在三种不同的测量条件:

• 静态的;这样样品的同一地区不断被曝光的激光
• 旋转;与样品旋转,跟踪一个约。15毫米圆在样品表面
• 旋转和线性翻译如上所述的15毫米的往复直线运动,以确保没有样本的一部分容易扩展激光曝光。

由此产生的光谱显示在图5。在静态配置,光谱表明样品经历了大量的破坏,没有明确的山峰之间可见700厘米¹和1500厘米¹。

图5。拉曼光谱的免疫球蛋白(30秒集成时间,平均10帧)。固体黑线=免疫球蛋白g以静态配置;黑色虚线表示免疫球蛋白测定样品旋转期间观察;红线免疫球蛋白与一个复杂的运动测量应用使用一个旋转和线性阶段。图片来源:IS-Instruments有限公司

数据的质量可以提高使用一个旋转阶段和高峰在这个地区变得突出。然而,他们2 - 3倍低于结构观察到1605厘米¹。

附加的线性过渡大幅提高光谱质量,表明没有损坏的时间段内测量。这个复杂的运动是用于所有剩余样品的剩余部分中描述。

此外,一系列的免疫球蛋白生成在去离子水稀释。总共11个样本组织从0.1毫克/毫升到2毫克/毫升:图6中展示了其中一个子集。所有光谱是10的结果平均帧,每个获得一段30秒的积分时间。

图6。拉曼光谱的免疫球蛋白浓度范围的标记(所有光谱是10 x 30秒的平均输出帧。图片来源:IS-Instruments有限公司

光谱表明,作为免疫球蛋白浓度走向0.1毫克/毫升,水光谱表明更大的可视性。推断的免疫球蛋白检测极限0.08毫克/毫升的水。

主成分分析(PCA)和主成分回归(PCR)是一个工具通常用于跟踪物种的分析来提取浓度值在一个特定的目标。分析了光谱进一步利用PCR模型。的目的是确定潜在的定量分析工具。

该模型利用一个30秒的每个样品光谱的框架,数据分为训练和数据集使用K-folds交叉验证方法。然后运行主成分分析。

图7。图显示免疫球蛋白PCR-calculated与实际样品浓度。图片来源:IS-Instruments有限公司

随之而来的输出产生免疫球蛋白浓度计算值。这是对真正的浓度,绘制如图8所示。

误差的标准差来衡量个人的框架,与准确性水平从0.03毫克/毫升的低浓度样品0.1毫克/毫升样品浓度越高。数据表明一个杰出的线性关系回归系数为0.99。

为了进一步评估工具的效用,色氨酸,常见的氨基酸,是评估。这个样品的拉曼光谱被采取的平均10帧,每捕获一个30秒的积分时间,显示在图8所示。

样品浓度为1.038 mg / ml.样本轮换和线性防止样本退化正如前面详细的翻译。

生成的干涉图,空间外差光谱仪、FFT算法之前经历最少的处理。这是由平场校正消除仪器畸变和花键适合提取纤维强度剖面。没有应用光谱平滑。

此前,熊本et al。¹⁵提出了一个好看色氨酸拉曼光谱利用2厘米¹解决气体泵浦激光器的单色仪在244海里。

图8中的光谱比较有利,所有山峰解决,包括双峰值为1342厘米¹/ 1359厘米¹。然而,相对这个频谱在相对较短的时间获得的最先进的合成技术取代扫描单色仪详细的在之前的研究中。¹⁵

图8。拉曼光谱的色氨酸。图片来源:IS-Instruments有限公司

域抗体(涂)拉曼收购

Cytiva生命科学提供欧洲杯线上买球一系列域抗体(dAb)甲壳内的挑战项目¹⁶还研究了。民建联甲壳试验性生产设施中心,乌普萨拉,开发演示技术,促进市场创新,同时促进Cytiva的产品,如树脂、过滤器、生物反应器等。

这个过程的目的是生产和净化领域抗体片段,即。抗体的可变区kappa轻链。抗体片段用于诊断或治疗性应用程序将以类似的方式,尽管更严格的例程(GLP或GMP标准)和净化最终产品到一个更高的学位。

五个样品从净化过程的各个部分获得退出并存储在-20°C,以备后续分析深紫外拉曼仪器。样品的列表如表2中可以看到。

表2。少量样品的列表。来源:IS-Instruments公司。

	样本	描述	评论
1	发酵结束	在收获上层清液样本 (热处理破坏周质和释放轻拍)	原油样品的污染物(宿主细胞蛋白质和DNA、文化媒体组件等等)。
2	蛋白L负载	样品在澄清步骤(TFF使用中空纤维)色谱法捕获步骤之前(蛋白L树脂)	细胞碎片和大型污染物移除。交换缓冲区。
3	蛋白L池	样本混合分数的蛋白质L色谱法捕获步骤	L是蛋白质的主要净化步骤(亲和树脂)
4	Capto MMC加负载	原则上应与蛋白L池但可能在不同的缓冲?
5	加Capto MMC池	样品后多元层析(抛光)的步骤	抛光的步骤进一步取消类毒素和宿主细胞蛋白(名为ECP下面的图)

每个样品测定免疫球蛋白和色氨酸观察对应相同。合成光谱可以看到如图9所示。不同的早期过程样本之间的差异是见过;样品标记“发酵的终结”和蛋白L负载和随后的净化措施。

图9。拉曼光谱提供的少量样本外种皮中心Cytiva生命科学。欧洲杯线上买球图片来源:IS-Instruments有限公司

整个谱峰的相对高度,细微的差别之间还可以看到剩余的样品。这可能是由于各种涂浓度在每个样本。

此外,额外的敏感性进行了评价。一系列capto L池民建联样本稀释成五个不同浓度,如表3所示。拉曼光谱显示在图10中。

图10。拉曼光谱的样品稀释在表3。图片来源:IS-Instruments有限公司

表3。民建联稀释。来源:IS-Instruments公司。

稀释	民建联浓缩的。(毫克/毫升)	样卷(µL)	缓冲卷(µL)
100 x	~ 0.1	20.	1980年
20 x	~ 0.5	50	950年
10倍	~ 1	One hundred.	900年
2 x	~ 5	500年	500年
1 x	1 x	1000年	0

每个光谱显示来自平均10帧,每一帧被收购在30秒的集成。

低浓度样品的溶剂(PBS -主要水)可以看到,在1628厘米^{- 1},低于1000厘米¹稳步提高,光谱仪器的光谱范围的边界。观察到随着浓度的增加,不仅水特性消除,但独特的民建联山峰变得更加杰出。

的PCA分析准备民建联的免疫球蛋白g数据重复数据。阴谋,展品计算与实际浓度显示在图11中。

观测线性问题再次被视为优秀的回归系数为0.989。单个样本的误差更大的少量的采样点的浓度范围。

可以预期,在生产设备部署方案,增加样本的数量可以用来构建一个校准模型,从而提振信心在单独的测量。此外,分析可以通过充分利用改进的300秒的数据集,而不是依靠一个30秒的框架。

图11。情节展示民建联PCR-calculated vs实际样品浓度。图片来源:IS-Instruments有限公司

结论

总之,一个创新的、紧凑、可靠的深紫外共振拉曼仪器引入了。系统汇集了最近开发的二极管激光器从TOPTICA光子学和空间外差光谱仪。

的集成两个已经结合成一个单一的仪器与小说反映后向散射拉曼探针集合。样品损伤扩展激光照射的结果已经通过引入动态有限样本定位阶段。

大量的生物材料已经使用UVRRS仪器评估:免疫欧洲杯足球竞彩球蛋白、色氨酸和域抗体。每个样本产生了独特而显著的拉曼光谱。

变量的样本浓度也被进行了分析,证明了极好的线性特征的效用为定量分析仪器。检测阈值< 0.1毫克/毫升建立了免疫球蛋白。

域的序列抗体由甲壳中心,一个生物过程半工业规模技术展示和创新设备由Cytiva生命科学、成功的特点。欧洲杯线上买球

这证明了技术的潜力来监测生物技术生产工艺,同时确定样品浓度。概述了仪器的潜力来提高生产产量和显著降低损耗。

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