当治疗蛋白形成聚集,他们可以限制临床疗效和可能引发一个严重的免疫原性反应。耐热性筛选,的方式温度斜坡经常使用的的方法来评估聚合的倾向各种各样的候选分子和形成条件。
这种类型的筛选通常是在高通量的方式进行的应用程序动态光散射(DLS)、固有荧光和/或其他方法来量化关键属性,如熔化温度(T米)或聚合的起始温度(Tgg)。
的DynaPro NanoStar利用直观的车载应用,动态联系,指导测量和无电梯的操作。先进的分析如出现温度进行使用full-fea-tures动力学软件,运行在一个标准的Windows电脑。图片来源:怀亚特的技术
准确测定Tgg对biotherapeutic产品的风险评估是至关重要的。多域蛋白、单克隆抗体是暴露在许多展开步骤和由于各种聚合动力学在热筛选。
本文概述了热的影响斜坡率曲妥珠单抗(赫赛汀的展开和聚合行为®)。一个DynaPro®NanoStar®cuvette-based DLS / SLS乐器在耐热性筛选表明,升温速率的选择是一个关键因素,当获取有意义的结果。
介绍
单克隆抗体(mab)是最常利用的biotherapeutics由于其直接目标细胞治疗和组织能力或精度交货的小分子药物。使用情况下mAb-based药物包括癌症、传染性疾病、哮喘和心血管疾病。
自马伯通常由两个轻链和两个重链、安排分为三个领域,结构和稳定性的变化,他们的发展通常会导致大量的中间状态,总有不同的可能性。
马伯聚合在医药产品的影响范围从简单的功效损失严重患者的免疫原性。因此,准确的描述抗体的稳定性和精度已成为一个关键要求有效的检查和批准mAb-based疗法。1
斜坡率的重要性
耐热性筛选技术,有能力评估在温度增加蛋白质的理化性质。这种实验通常包括筛选各种配方条件如pH值、盐浓度和辅料。
使用DynaPro板读者,实验可以自动在传统microwell板块进行高通量分析。
而简单的蛋白质热稳定性的实验可能不是升温速率的影响,也有例外像马伯,与他们多步展开,选择合适的加热速度很重要。
加热率被认为是过度可能导致相对缓慢的展开或聚合事件分配给一个更高的温度而发生在较低的温度下发生。
这个事件可能导致假设稳定高于实际上是如此。因此,它不仅是良好的实践但绝对必要的比较结果获得在同一实验设置,并评估温度斜坡率测量的影响Tgg。
DLS是一个很好的技术,建立水力半径(Rh),一个参数,增加与本机状态演变和聚合。DLS搭配温度斜坡促进T的量化米或Tgg通过测量尺寸在整个温度范围内的变化。
如果静态光散射(SLS)同步记录,可以使分离聚合展开评估的变化衡量摩尔质量(Mw分析物)。
测量DLS和SLS温度斜坡
DLS的DynaPro NanoStar同时措施,使用专用的SLS,优化检测器模块为每个类型的测量。它还提供特殊的温度控制,这抵消了溶液温度与仪表温度滞后发生由于石英电池和液体的热质量。
这生成一个精确的斜坡,在广泛的温度范围。2µL样品可以分析每个候选人或条件。
NanoStar是用来评估的影响斜坡率明显的热稳定性的曲妥珠单抗(赫赛汀),马伯,商用和用于乳腺癌的治疗。
这项研究调查了升温速率对T的测量值的影响发病,展开或聚合生成的温度增加了Rh和Mw。
欧洲杯足球竞彩材料和方法
曲妥珠单抗收购以粉末形式(Sigma-Aldrich)和resolubilized在传统PBS缓冲的最终浓度1毫克/毫升,然后透过0.02µm syringe-tip过滤器。
每个热的斜坡实验2µL曲妥珠单抗的解决方案是传递到一个干净的校准石英试管和一滴硅油是仔细定位阻碍蒸发。热稳定性是评价使用DLS, SLS DynaPro NanoStar。
两个Rh和Mw测量在不同的温度范围从25°C到90°C匝道利率从0.1°C /分钟2.0°C /分钟。数据采集完成后在每个温度点3收购3秒。
累积量开始使用动态进行了分析®软件计算Rh和T发病。分布的情节是利用NNLS正则化分析为基础。
结果与讨论
DLS分析表明,Rh5.5 nm曲妥珠单抗在25°C,这是常见的一个单体的,本地折叠马伯,2米w~ 140 kDa的衡量SLS突出表明,mAb是单体的,它类似于摩尔质量计算从~ 150 kDa的序列。
图1展示了正则化直方图与一个狭窄的峰值,表明只有单体的抗体的存在25°C,因此,高阶物种的样本最初免费或聚集。
图1 b展示了热应力导致聚合,提出的正则化直方图在90°C。
图1所示。曲妥珠单抗的自相关函数和正则化直方图25°C和90°C。图片来源:怀亚特的技术
在慢速和快速坡道耐热性
升温速率的影响对曲妥珠单抗的所谓的热稳定性是仔细评估通过记录DLS和SLS数据同时进行温度斜坡在不同的利率。
表1显示了T发病每个加热速度和测量类型,而图2比较突出的热稳定性,测量在升温速率最慢(0.1°C /分钟),最快的加热速度(2.0°C /分钟),在本研究应用。
表1。曲妥珠单抗温度(T发病从DLS (R)计算h)或SLS (Mw)记录在不同的加热率。来源:怀亚特科技
升温速率
(°C /分钟) |
T发病从DLS
(°C) |
T发病从SLS
(°C) |
| 0.10 |
71.8 |
71.0 |
| 0.25 |
74.3 |
73.5 |
| 0.50 |
75.6 |
74.8 |
| 1.00 |
77.2 |
76.8 |
| 2.00 |
78.2 |
77.8 |
两个Rh和Mw马伯似乎未受影响的70°C(图2)。超过这个阈值,有一个半径和摩尔质量的增加。
图2。升温速率对曲妥珠单抗的热稳定性表征DLS (Rh)和b) SLS (Mw)。图片来源:怀亚特的技术
T发病DLS 71.8°C的最慢的,最快速的升温速率为78.2°C。一个类似的结果是获得了在计算T发病从SLS: 71.0°C和77.8°C慢和升温速率最快,分别。
R的增加h和Mw发生在相同的出现,这表明,聚合是积极而不是发生演变。马伯似乎总在低温下如果加热速度慢。
这表明早期演变发生在~ 71°C,进而导致缓慢聚合。
缓慢聚合的组合在71°C和斜坡率高的温度的快速转换生成一个7°C T的明显增加发病2.0°C /分钟。因此,很明显,斜坡率的选择直接影响结果:斜坡速度过快产生显著误差的热稳定性评估。
T发病从DLS和SLS相比
T发病DLS和SLS爆发表明,温度从SLS的发病通常略低于DLS(表1)。图3对比Rh和MW针对温度在0.1°C /分钟和2°C /分钟加热率。
图3。差异是观察发作的Mw和Rh加热利率之间的)0.1°C /分钟和b) 2.0°C /分钟。图片来源:怀亚特的技术
而发作在最高斜坡率非常相似,很明显,发病较早w在最低的斜坡率与Rh。SLS通常更容易聚合形成,所以即使展开不能使用DLS,聚合被SLS。
此外,它是可行的,明显的增加w没有相应增加,Rh是瞬态的产物self-association,增加对构象的变化发生在马伯,不直接影响Rh。
映射斜坡率和明显的T发病
一个可能的解释缺席的发病速度最快的斜坡可以早些时候展开~ 71°C左右结果较慢的聚合过程中比在什么被认为是完整的展开和后续聚合在~ 78°C。
因此,应用程序的几个加热率介于0.1°C /分钟和2°C /分钟完成建立R的发作h和Mw(表1)。图4说明了一个明显的增加,T发病从DLS、SLS与越来越斜坡率有关。
图4。T加热率的影响发病曲妥珠单抗的观察DLS (Rh)和SLS (Mw)。图片来源:怀亚特的技术
聚合热稳定性实验期间发生在展开揭示疏水残基通常隐藏在蛋白质内部,这(通常)会导致不可逆转的self-association。
聚合过程是依赖于温度,这表明随着温度的增加,聚合的速率增加。在此基础上,越早开始看到在减少加热速度慢得多的结果聚合过程与部分展开的蛋白质。
当升温速率增加,减少在每个温度步骤所花费的时间,减轻聚合发生的机会,而高温鼓励聚合过程的速度。
这些对立的影响导致转向更高的开始温度和升温速率增加,直到完全展开的马伯成为主要的来源聚合在加热率最高。
总之,聚合,结果部分展开马伯相比是一个减速的过程完全展开的蛋白质的聚合解释缺乏早期发病斜坡率最高。
结论
热稳定性研究的关键biotherapeutic表征和候选人和配方的最佳选择。虽然不是通常与升温速率有关,快坡道可能掩盖慢,早发性聚合如果展开是一个逐步的过程。
了解斜坡率影响这个过程可以很容易地解决DLS和SLS测量在一个DynaPro NanoStar。
NanoStar应用精确温度控制覆盖广泛的温度范围从-10°C + 120°C与极低消费——大约只有2µL示例。时选择的仪器是理想的仪器在复杂和富有挑战性的热稳定性研究有限数量的样本。
高通量筛选,DynaPro板读者可以进行热稳定性测试在传统microwell盘子。
虽然DynaPro板读者没有能力进行温度斜坡NanoStar以相同的速度,本文表明更快坡道可以产生相当大的失误马伯的热稳定性和其他biotherapeutics。
引用
- 巴塞尔,y . et al,“物理化学稳定性的单克隆抗体:审查”,j .制药。科学,109 (10):169 - 190 (2020)。https://doi.org/10.1016/j.xphs.2019.08.009
- AN5005:洛杉矶,a . et al,“马伯的表征和配方筛选和抗体药物配合(adc)高通量DLS”。https://www.wyattfiles.s3-us-west2.amazonaws.com
这些信息已经采购,审核并改编自怀亚特提供的材料技术。欧洲杯足球竞彩
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