本文讨论了高速原子力显微镜（HS-AFM）的扫描后图像处理的最新进展，用于复杂生物分子的超高分辨率成像。
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成像生物分子的复杂性
分析生物分子的结构和物理化学特性是生物技术研究的主要研究领域。生物大分子的四种主要类型，即碳水化合物，蛋白质，核酸和脂质具有复杂而动态的共形态，其中蛋白质具有最多样化的形状，大小和结构。
传统的电子显微镜（EMS）适用于大多数分子结构的高分辨率成像，直至亚纳光量表。但是，生物分子通常容易受到电子轰击的影响。此外，EMS只能在真空条件下进行操作，这些条件需要重建或孤立的大分子组件，远离其原始环境条件。
这些孤立的生物分子可以与原始的结构状态不同。最近的一些研究使用了冷冻EM和低温X射线晶体学，这些晶体学基于生物分子和液体培养基的凝固。但是，由于温度，压力，分子力和缓冲液交换的变化，它们无法给出生物分子动态保形状态的实时图像。
同时，AFM已成为分析生物分子领域的EM的补充解决方案。AFM是材料科学中广泛使用的仪器，用于扫描物理特性和通过直接物理相互作用等2D表面（例如欧洲杯线上买球地形，磁力和静电力）的局部力量。此外，它可以在真空，空气和液体培养基下进行操作，几乎没有或根本不需要样品制备。但是，在映射生物分子时，HS-AFM仍然存在一些挑战。它们包括AFM探针尖端的有限清晰度以及在液体培养基中生物分子的分子链的海绵。
新的本地化AFM技术
已提出了一种新的本地化AFM（LAFM）技术Heath等。为了克服上述物理局限性，使用后期探测图像处理方法。研究人员用类比解释了这种方法，其中篮球（类似于AFM探针尖端）被丢弃在包含大量乒乓球（类似于生物分子的分子块）的场上，随机悬挂在空气中（即，即分子块的平均位置）。弹跳每个乒乓球的高度将是其平均位置的量度。
LAFM技术使用双色插值方法扩展了扫描的图像，该方法准确地测量了来自样品图像的几个紧密位置分子块的分离信号的局部最大值（即峰位置）。使用本地化算法在单个帧中合并这些局部最大值会导致高于初始像素采样的分辨率。但是，该方法最适合在附近没有更高功能的扁平样品。这为单个框架上的所有分子块提供了相等的参考平面。
测试LAFM的有效性
该团队首先使用LAFM技术在Aquaporin-Z表面的成像功能（aqpz）四聚体通道，一种在细胞膜中携带水的蛋白质，看起来像单一突出环。他们能够通过间距来检测隐藏的结构特征2.6Å，使用其他类似的方法（包括从Nyquist频率的原始数据（1/（6.6Å））获得的方法）小得多（即11Å）。对于AQPZ，A5和A5 P13W-G14W，使用LAFM的氨基酸蛋白分辨率分别为4.0Å，5.1Å和4.5Å。
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此外，为了研究LAFM对缓冲液培养基中生物分子的有效性，研究人员使用了CLC-EC1，A CL-/H+来自大肠杆菌。高分辨率的动态实时映射表明，从其膜突出的二聚体蛋白表现出pH依赖性的保形状态变化。
结论
LAFM是一种有前途的基于算法的后期探测图像处理方法，可获得高分辨率AFM映射，有助于克服传统HS-AFM的物理局限性，以映射非常小的生物分子链。LAFM即使在非刚性状态下的生物分子，LAFM也提供了超出尖端半径限制的分辨率。
它也是EMS的合适替代方法，它无法在其原始环境条件或动态情况下绘制这些分子。随着时间的流逝，可以对一个或几个帧或单个分子进行许多分子进行LAFM映射，并很快成为复杂生物分子的标准表征方法。
参考和进一步阅读
希思（G.自然，594，，，，385–390（2021）。https://www.nature.com/欧洲杯猜球平台articles/s41586-021-03551-x
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