对细胞生物功能的彻底理解需要了解细胞膜的特定成分，结果是蛋白质复合物的结构和组织以及高分辨率研究的工具。通过利用Freeze-Fracture技术通过断裂和复制对膜的准确描绘，可以通过使用冻结技术的精确描绘来进行此类高分辨率研究。
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简要介绍和方法论
将冷冻材料分裂以披露内部特征的方法称为冻结。它需要使用透射电子显微镜通过断裂表面进行物理分离（分级）结构的生物样品。冷冻时，生物膜在其疏水核中具有固有的脆弱平面，因此，如果样品破碎或骨折，则裂缝区域经常将屏障分离为半膜裂片。
结果是细胞质膜排列的三维图像，并带有内部屏障的视角。通过创建裂缝平面的非常精确的铂 - 碳副本，可以在电子显微镜下看到这些特征。
历史起源和发展
50多年来，在显微镜结构和生物学研究中，冻结裂缝电子显微镜被广泛接受为重要方法。尽管该方法的组成部分早在1950年代就出现在早期阶段，但其潜力吸引了1960年左右的细胞生物学家的注意。
最初，解释性冲突阻碍了冻结的使用，但是一旦对这些进行了纠正，该方法在1970年代和1980年代就繁荣起来，在解释蜂窝膜和质体的结构组织方面提供了突破性的突破性，传统的薄片显微镜可能无法使用。达到。
脚步
创建Freeze-Fracture副本有四个过程。试样必须在初始阶段迅速冷冻。然后在低温下积极地骨折标本。第三阶段是铂和碳的真空涂层，以产生冷冻破裂的表面的重复，然后洗涤复制品以消除任何生物材料。此外，冻结过程经常在预处理后执行，并且可能在破裂和复制品创造之间包括补充蚀刻步骤。
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快速冷冻的通常方法是快速浸入液体冷却液中的正确固定样品（例如亚冷液氮）。遗憾的是，直到以前用冷冻保存预处理为止，以这种方式保存的大多数生物样品都表现出超微结构冰晶降解。甘油是最常用的冷冻保护剂。
复制品分为两个步骤：阴影和背面。在通常的方法中，倾斜的定向阴影是通过将铂 - 碳的薄涂层蒸发到样品上来完成的，然后迅速进行电子胶状碳增强（衬里）薄膜，从上方凝结。从而将冷冻，破碎的表面的地貌元素转化为复制品植入的铂覆盖深度的变化。获得复制品后，样品暴露于标准的大气压并受到环境温度的影响。次氯酸钠溶液，铬酸或其他清洁化学物质用于消除复制品的生物分子。
好处
Freeze-Fracture电子显微镜（FEM）是一种独一无二的研究技术，为微生物学家提供了许多重要的优势。对于初学者而言，由于它是一种复制方法，因此它可以提供生物成分的面向和横截面视角，使研究人员精确地观察了裂缝平面内部和膜表面上特定特征的结构和分散。
即使利用了生化预处理，它也提供了进一步处理的额外技术，从而可以比较薄片电子显微镜和FEM统计学。此外，当与单纯的物理样品保存方法（例如冷冻固定）结合使用时，FEM可以完全消除生化固定的必要性，使其对于检测人为特征特别有用。
方法和用途
为了处理生物材料，已经研究了两种不同的冻结裂纹程序。在第一种方法中，首先将生物组织固定和干燥，然后将其冷冻，碎片，绝对酒精和临界点干燥。当检查肾脏中肝脏正弦或鲍曼胶囊等自然解剖学差异的细胞的管腔区域时，这种方法会产生良好的结果。通常，这种初始方法揭示了有关细胞的细胞质膜或细胞核仁的信息，因此探索了第二种方法。
第二种方法涉及组织样品或淋巴细胞最初注射冷冻保存，冷冻，破碎且直到融化后才修复。最后，固定细胞脱水。这种特殊的方法已用于研究哺乳动物组织，胡萝卜原生质体和叶子分生组织细胞。
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这冻结系统leica em ace900是此过程的有效设备。2020欧洲杯下注官网Leica EM ACE900样品制备系统可以进行冻结，冷冻蚀刻和电子束涂层，而无需使用任何额外的工具。
什么是Ultrarapid冻结？
尽管可以通过正常的暴跌冻结而无需进行冷冻保护处理的几种类型的水分浓度较低的样品可以有效地保留，但在大多数情况下，快速冻结需要超脂质的冻结程序。这些程序旨在提高样品的冷却速率，以防止在未预处理样品中发生的冰晶体恶化。最佳的爆发，喷射冷冻和喷雾冷冻是主要的超级冻结程序。
最新研究
该期刊的最新研究星协议描述了如何使用FEM定位磷脂酰胆碱（PTDCHO），该磷脂酰胆碱是通过酵母中的肯尼迪路线新鲜生成的。内质网合成了PTDCHO，这是一种关键的跨膜磷脂。该方法包括对淋巴细胞的可单击的胆碱类似物，快速冻结，冻结裂缝复制品产生，结合和免疫元标记。这种方法可用于量化哪些屏障襟翼已新鲜产生的PTDCHO集成。
最近，正在研究和开发新的冻结显微镜技术的新方法，例如高压冻结技术。这些方法将克服传统的局限性，为与遗传学，生物工程和医疗行业领域有关的研究人员铺平道路。
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参考和进一步阅读
Tsuji，Takuma和Toyoshi Fujimoto。2021.通过冷冻裂缝电子显微镜在酵母细胞中从头合成的磷脂酰胆碱的超微结构定位。星协议。2（4）。100990.可用：https://www.欧洲杯线上买球sciendirect.com/science/article/pii/s26666666721006961?via%3dihub
Leica Microsystems，2022年。冷冻断裂系统Leica EM ACE900。[在线的]
可用网址：https://www.leica-microsystems.com/products/sample-preparation-for-electron-microscopy/p/leica-em-ace900/
Meier，Carola和Anja Beckmann。2018。冻结：体外细胞超微结构分析的新途径。组织化学和细胞生物学149（1）.3-13。可用网址：https://link.springer.com/article/10.1007/s00418-017-1617-x
Kaech，Andres和Urs Ziegler。2014年。高压冻结：当前状态和未来前景。电子显微镜。Humana Press，Totowa，新泽西州。151-171。可用网址：https://link.springer.com/protocol/10.1007/978-1-62703-776-1_8
Severs，Nicholas J.，2007年。冻结骨折电子显微镜。自然协议2（3）。547-576。可用网址：https://www.nature.com/欧洲杯猜球平台articles/nprot.2007.55
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