深紫外拉曼生物制剂分析空间外差光谱仪

众多批准单克隆抗体类生物制药产品的一系列疗法正在上升,预计将迅速扩张。这包括sotrovimab的近期发展和ronapreve COVID-19治疗。

尽管展示最近的重大成功,继续供不应求和抗体生产限制的时间和开发成本。单克隆抗体和抗体片段是昂贵的和任何系统,可以提供感兴趣的数据来提高他们的生产制造商。

scFv抗体片段(例如,工厂,轻拍,等)被视为一个越来越重要的蛋白质biotherapeutics类。由于其结构和规模较小,抗体片断表现出有用的属性(例如,简单的组织渗透)适应范围的治疗和诊断的应用。

然而,一个缺点是,他们在低浓度是难以量化的,他们需要一个高度的特异性提高生产和增加产量。因此,新的和增强的过程分析技术(PAT)相当大的兴趣。

十多年来,拉曼光谱已被确定为一个可能的测量方法在生物制剂生产中的应用。目前,它是利用生产一些产品,但有一些相当大的缺点限制了其应用在许多领域。

技术是无损和原则可以用来量化任何分子提供高特异性和敏感性数据,从而提供纯度和浓度信息。

但拉曼观察此类产品尤其困难的在低浓度(毫克/毫升),由于目标的弱散射截面样本。

此外,一些复杂的生物物质,例如,抗体片段,说明非常强大的荧光反应通常掩盖了喇曼签名。这妨碍了拉曼光谱的应用作为一个在线拍工具。

深紫外共振拉曼光谱(UVRRS)已经被许多作者利用作为一个潜在的方法来跟踪生物制药产品的制造。^1、2、3

在< 250纳米操作,目标拉曼光谱和荧光响应成为幽灵似地分开,从而揭示了喇曼响应成功抓获。此外,随着激光波长减少低于250纳米时各种有机分子的电子跃迁产生共振效应,增强拉曼信号由几个数量级。^{4、5、6所示}

目前高性能的远紫外线仪器操作低于250 nm利用气体泵浦激光器,^4、5应水冷和干燥氮气净化,从而使他们难以部署在一个制造工厂。

应该注意的是,激光商业化操作在257和261 nm已用于拉曼观察。然而,这些波长太长提供所需的共振信号从抗体样品和类似的产品。另一种方法是利用CuNe激光作为部署在火星上坚持不懈的使命。⁷

这些不需要激光冷却和比较紧凑。但这些伪脉冲激光的净功率< 1兆瓦,限制其应用强烈散射或高度集中的样本。

通常情况下,这些工具是耦合的一个冷却的CCD和高性能色散光谱仪。光谱仪通常会利用25μm(或更少)缝保证光谱是好看。

保证最大的光收集在这个协议中,激光点在目标需要保留下面这个狭缝宽度,从而导致目标样本接触非常高的功率密度,集体的高光子能量会损坏样品。^8、9

此外,该决议要求获得高质量激光波长的拉曼光谱谱仪测量结果低于250海里,对环境条件十分敏感。这经常需要定期调整。

这样的困难,到目前为止,有限的采用深紫外拉曼仪器学术实验室和非常特殊的研究应用,比如火星探索任务。

而且,到目前为止,辅助需求和高运行成本有严格限制UVRRS系统在线帕特工具的部署,生物制剂生产可以促进和改善的地方。

需要解决这些问题,作者提出了一个新的紧凑深紫外拉曼仪器的帮助下一个二极管抽运激光和一个空间外差光谱仪(合成)¹⁰集成了一个反映拉曼探针集合。

合成提供了展度> 100倍的好处相比,色散光谱仪,非常类似于提供的干涉方法(例如,迈克尔逊干涉仪,基于法布里-珀罗系统),在一个小稳健设计在缺乏复杂的定制的光学。

二极管抽运激光使仪器保留一个小的形式因素,同时提供优秀的稳定性和性能特征。二手烟使一个巨大的光导致吞吐量相对大激光点目标,从而减少功率密度感应样品损失。

仪器已经说明成功捕捉一系列生化样品的拉曼光谱,如免疫球蛋白G(免疫球蛋白)在不同浓度、色氨酸和一系列域抗体(dAb)样本。

提取少量样品是在飞行员生物反应器制造过程的不同阶段,在不同的稀释。这是第一次观察这种由作者。

实验或仪器开发

的CAD图像仪(与外壳消除)提出了如图1所示。该系统包括(a)生产的二极管泵浦激光TOPTICA光子学,(b)一个啦,和(c)反射拉曼探针集合,由IS-Instruments。形式的主要仪器包括45 75××35厘米光谱仪通过光纤电缆和接口。

图1。全系统的CAD图像:(A) TOPTICA激光头,ISI他光谱仪(B)和(C)后向散射拉曼探针集合。图片来源:IS-Instruments有限公司

激光

一个新的深紫外激光系统(TopWave DUV),功能为228.5 nm设计TOPTICA光子学(图1)。这个不需要水冷或内部气体的排除,从而大大简化操作。

这个激光源是一个紧凑的足迹和改善取决于二极管抽运固体激光器(全固态)技术。全固态泵浦激光器用作低噪声,提供近200 mW的输出功率基本波长457 nm。

这是频率转换成深紫外线的帮助下二次谐波产生(宋惠乔)的过程。输出功率> 10兆瓦的紫外线已经获得的积分宋惠乔过程改进增强腔。这使转换效率超过13%,最大的紫外线20兆瓦的力量。

样品界面

拉曼探针集合是一个反映设备,激光已经针对样本通过把镜子将光线在示例如图2所示。样品的位置用一个红色箭头来表示。

图2。CAD instrument-sample接口的图像。红色箭头表示样品的位置。图片来源:IS-Instruments有限公司

背散射收集拉曼光通过一个12.5毫米焦距f1:1镜子。的光将会通过一个229 nm长传球滤波器抑制无关的激光聚焦到一个之前0.91毫米直径纤维集合,通过25毫米直径50毫米焦距镜子。

然后,光光纤耦合到光谱仪的光谱数据提取。合成谱仪的设计保证不丢失光尽管大型展度的需求。¹¹

同时,动态定位阶段样品的选址如图2所示(以下样品阶段)。这有助于扫描常规拉曼测量期间,保证不损坏样品扩展激光曝光。

谱仪

空间外差光谱仪由配置如图3所示。操作的设计呈现本身深紫外线,在功率密度、分辨率和稳定性需要非常严格的。

图3。空间外差光谱仪UVRRS所使用的设计工具。UVRRS、紫外共振拉曼光谱。图片来源:IS-Instruments有限公司

最初,这个设计是由哈兰等(1992),研究扩散的对象。许多团队适应了喇曼观测设计的一系列激发波长。^12、13、14

仪器被认为是一个类的静态傅里叶变换光谱仪,因此图像的干涉图进行傅里叶变换提取光谱信息。

设计提供了各种福利;它提供了一个相当大的展度对色散系统中获益,这使得目标样本点的增加,从而减少了功率密度不丢失任何聚集光。

干涉仪配置允许获得高分辨率与适度的光栅的线密度不需要增加仪器的足迹。设计本质上是稳定波长空间,减少仪器的任何需要调整。

光谱仪是光纤耦合的拉曼探针通过0.91毫米直径0.22 NA光纤。谱仪不需要缝,消除这种常见的光学损失。

仪器利用光栅400线/毫米,边缘模式isimaged通过三合紫外线透镜(减少畸变)的帮助下冷却和或iDUS CCD相机。

Lamsal¹⁵说明紫外线合成仪器利用分割板分束器来限制任何失真新兴板平面度。

但这往往延长光栅和其他光学元素之间的距离,它放大任何运动光栅板由于环境条件。因此,定制的立方分束器的平面度228.5λ/ 10 nm捏造并集成到工具。

谱仪的校准环己烷的帮助下显示一系列著名的山峰从801到1444厘米⁻¹。

结果与讨论

免疫球蛋白和色氨酸

同时在远紫外线功能,目标样本往往经验非常高的辐射能量。这可能导致伤害,随后降低获得的光谱作为目标材料退化和/或损坏。

合成设计有助于减少这个通过允许一个更大的目标(0.3毫米直径,在这种情况下)如果一个人认为70%的效率对系统发送到目标,这将导致总功率密度89.2千瓦/ m²被指出的目标。

高性能分散相似的光谱分辨率的仪器需要10μm宽缝。

因此,现场应保持在这个水平,如果没有光必须在提高功率密度> 80 MW / m²,大大增加伤害的可能性被观察到。

为了评估这种效果,免疫球蛋白,容易紫外线退化,进行了分析。在30秒的帮助集成时代,获取此数据,平均10帧用来产生光谱。

免疫球蛋白g谱是在三个不同的测量条件:

• 静态的;这样,同一地区的样本不断暴露于激光
• 旋转和线性翻译;15毫米“往复直线运动,以保证没有接触区域的样本扩展激光
• 旋转;与样品旋转,跟踪样品表面15毫米循环

随之而来的光谱显示在图4。静态配置,光谱表示大量的损害已经发生的示例中,没有明确的山峰700至1500厘米⁻¹。

图4。拉曼光谱的免疫球蛋白(30年代集成时间,平均10帧)。固体黑线:免疫球蛋白是测量静态配置;黑色虚线表示:免疫球蛋白测定样品旋转期间观察;红线:免疫球蛋白与一个复杂的运动测量应用使用一个旋转和线性阶段。免疫球蛋白、免疫球蛋白G。图片来源:IS-Instruments有限公司

利用旋转阶段收集的数据的质量提高与峰值在这个地区变得更加突出。但是他们是两到三倍相比弱结构表示为1605厘米⁻¹。

线性的翻译明显提高光谱质量不增加的时间测量。这对所有样本提出了采用复杂的运动。

光谱实现密切在右脑的情况下繁殖在文献中报道。¹⁶这个测量早些时候表示,可能是影响UV-induced样本退化。

此外,一系列的免疫球蛋白在去离子水稀释。这些变化从0.1到2毫克/毫升(总共11个样本)。的一个子集,这些已经呈现在图5中。所有光谱产品平均10帧,每捕获一个30秒的积分时间。

图5。拉曼光谱的免疫球蛋白浓度范围为标签(所有光谱呈现的平均输出10 30年代框架);固体黑线= 0.1 mg / mL,黑色虚线表示= 0.4 mg / mL,蓝线= 0.8117 mg / mL,虚线红线= 2.0173毫克/毫升。免疫球蛋白、免疫球蛋白G。图片来源:IS-Instruments有限公司

光谱证明作为免疫球蛋白浓度降低到0.1毫克/毫升,水频谱变得更加突出。外推法表示的免疫球蛋白检测极限0.08毫克/毫升的水。

识别为定量分析仪器的能力,此外,研究了光谱与主成分回归模型的帮助。利用一个30秒的每个样品光谱的框架,数据分为训练数据集,使用K-folds交叉验证方法。¹⁷

也进行了主成分分析。随之而来的输出提供免疫球蛋白浓度计算值。这是策划反对真正的浓度,显示在图6所示。

图6。免疫球蛋白PCR-calculated vs实际样品浓度。免疫球蛋白、免疫球蛋白G。图片来源:IS-Instruments有限公司

误差的计算标准偏差的单独的帧精度水平改变从0.03毫克/毫升的低浓度样品0.1毫克/毫升样品浓度越高。数据显示一个杰出的线性关系回归系数为0.99。

一种氨基酸,色氨酸是进行分析,以进一步评估实用工具。这个样本的拉曼光谱获得的平均10帧,每个捕获30-sceond集成时间,显示在图7中。

图7。拉曼光谱的色氨酸。图片来源:IS-Instruments有限公司

样品浓度为1.038毫克/毫升样品旋转和线性翻译为了防止样本退化,详细。

生成的干涉图合成经历最少的FFT算法之前处理。这包括平场校正消除仪器畸变,和花键配合去除纤维强度剖面。没有光谱平滑。

熊本等。⁸早些时候提出了一个好看的帮助下色氨酸拉曼光谱2厘米⁻¹分辨率单色仪在244 nm的帮助下气体抽运激光器。

频谱如图7所示,相比毫不逊色与所有山峰解决,如双峰值为1342厘米⁻¹/ 1359厘米⁻¹。然而,相比之下,这个频谱得到一小部分的时间,由于先进的合成技术代替扫描单色仪用熊本et al.8来解释

用拉曼收购

一系列的轻拍提供的样品与不同的纯度和浓度Cytiva甲壳内的生命科学挑战项目欧洲杯线上买球¹⁸也进行了分析。半工业规模的生物处理设施外种皮中心,乌普萨拉,是一个技术演示开发帮助市场创新和鼓励Cytiva的产品,例如,过滤器,树脂、生物反应器等。

流程运行时的外种皮的挑战是计划生成和净化民建联片段,也就是说,抗体的变化无常的地区kappa-light链。抗体片段,用于治疗或诊断应用程序将以同样的方式,但更严格的例程(GMP或GLP标准)和最终产品的纯化到一个更高的学位。

5从净化过程的各个部分收集的样本被移除,储存在−20°C以下分析的帮助下深紫外拉曼仪器。所使用的样本显示在表1。这些样品是在一个相同的量化方法免疫球蛋白和色氨酸的观察。

表1。少量样品的列表。来源:IS-Instruments公司。

样本		描述	评论
1	发酵结束	浮在表面的样本在收获(热处理破坏周质和释放轻拍)	原油样品含有污染物(宿主细胞蛋白质和DNA、文化媒体组件等)从生产过程
2	Capto L负载	样品在澄清步骤(TFF使用中空纤维)色谱法捕获步骤之前(蛋白L树脂)	细胞碎片和大型污染物移除。交换缓冲区
3	Capto L池	样本混合分数的蛋白质L色谱法捕获步骤	L是蛋白质的主要净化步骤(亲和树脂)
4	Capto MMC加负载	样品之前抛光步骤(从亲和捕获洗出液pH值调整后色谱步骤)	在装货前样品加到Capto MMC与氢氧化钠pH值调整。所以,开始样品的浓度低于加Capto MMC的蛋白质洗脱池
5	加Capto MMC池	样品后多元层析(抛光)的步骤	抛光与类毒素和宿主细胞蛋白的进一步去除

缩写:轻拍,域抗体。

随之而来的光谱显示在图8。清晰的早期过程样本之间的差异指出;样品标记“发酵的终结”和“蛋白质L负载”和下面的纯化步骤。

此外,剩下的样品之间微妙的变化是可见的关于整个谱峰的相对高度。这可能是由于不同的民建联在每个样本浓度。

图8。民建联的拉曼光谱(样本提供的外种皮中心,Cytiva生命科学)来自五个不同阶段的制造过程(表1):黑色虚线表示(样本位置1),固体黑线(样本位欧洲杯线上买球置2),蓝线(样本位置3),虚线红线(样本位置4),红线和固体样品(位置5)。轻拍,域抗体。图片来源:IS-Instruments有限公司

此外,灵敏度进行评估。一个轻拍样品被稀释到5浓度显示在表2。介绍了拉曼光谱如图9所示。

表2。民建联稀释。来源:IS-Instruments公司。

稀释	民建联浓缩的。(毫克/毫升)	样卷(µL)	缓冲卷(µL)
100 x	~ 0.1	20.	1980年
20 x	~ 0.5	50	950年
10倍	~ 1	One hundred.	900年
2 x	~ 5	500年	500年
1 x	~ 10	1000年	0

缩写:轻拍,域抗体。

图9。民建联的拉曼光谱(样本提供的外种皮中心,Cytiva生命科学)不同浓度水平:虚线红线= 0.1 mg / mL,固体蓝线= 0.5 mg / 欧洲杯线上买球mL,黑色虚线表示= 1毫克/毫升,坚实的黑线= 5毫克/毫升,和固体红线= 10毫克/毫升。轻拍,域抗体。图片来源:IS-Instruments有限公司

每个光谱呈现的平均10帧,每一帧捕获在一个30秒的积分时间。低浓度样品的溶剂(PBS -主要是水)指出,在1628厘米⁻¹,低于1000厘米⁻¹在光谱不断增加仪器的光谱范围的边缘。

浓度的增加,水的特性不仅消除但特殊民建联山峰变得更加突出。

免疫球蛋白的PCA分析设计了数据是民建联的重复数据。情节显示估计与实际浓度显示在图10中。出色的线性度再次指出回归系数为0.989。

图10。民建联PCR-calculated vs实际样品浓度。轻拍,域抗体;PCR,聚合酶链反应。图片来源:IS-Instruments有限公司

独立样本的误差更大的结果在整个浓度范围限制数量的样本点。

预测,在制造工厂部署的情况下,增加样本的数量可以用来建立一个校准模型,从而提高测量他们的信心。此外,分析可以改善通过使用完整的300秒的数据集,而不是使用一个30秒的框架。

结论

一个新的、小型和可靠的深紫外共振拉曼仪器提出了。系统集成了一个新开发的固态二极管抽运激光器和一个啦,两个已经结合成一个单一的仪器有特殊反映后向散射拉曼探针集合。

样品损坏导致激光曝光延伸通过一个动态的mplementation样本定位阶段。许多生物材料研究的帮助下UVRRS仪器:欧洲杯足球竞彩色氨酸,免疫球蛋白和轻拍。

每个示例提供了一个独特的和著名的拉曼光谱。改变样品浓度也被分析,突出线性特征说明仪器的实用程序进行定量分析。

检测阈值< 0.1毫克/毫升为免疫球蛋白被发现。

一系列的轻拍样品生产甲壳中心——一个生物过程半工业规模技术展示和创新工具——由Cytiva生命科学已经成功为特征。欧洲杯线上买球

研究人员证明的能力技术跟踪生物技术生产过程,而同时识别样本的浓度。这强调了潜在的工具提高生产产量和减少浪费。

承认

作者感谢创新英国、欧洲之星/尤里卡,甲壳中心当前项目的资助和支持。

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