生物制剂生产的复杂性和质量设计的渴望(QbD)过程,需要及时、信息丰富的处理数据是至关重要的过程改进的经济、安全和效率。
QbD的哲学是依赖于有效的监测和控制在过程的早期,在上游制造业。然而,上游过程取决于多个分析技术监测监控几个关键工艺参数(cpp)。
只有少数技术监控产品关键质量属性(CQAs)直接与cpp CQAs经常间接得出监测。质谱(MS)是一个有价值的工具,可以使用一个监控关键CQAs和cpp技术。
过程的信息丰富和完整的视图由女士提供了一个更深层次的了解CQAs cpp的影响。这理解是基本完全实施过程分析技术(PAT)监测和控制过程。
女士的足迹、成本和复杂性的设备经常利用MS有限集中的实验室,阻碍女士从实施上游过程的2020欧洲杯下注官网实时监控的需要。
本文介绍了开发一个小型质,中期®ProteinlD(见图1),结合概念验证(PoC)工作流提供免疫球蛋白的监测和代谢产物在细胞培养和上游的需要。
图1所示。Microsaic中期®ProteinID质谱仪基于微型芯片技术与可调质量范围在50到3200 m / z的监测小分子在细胞培养中媒体和完整的免疫球蛋白是可能的质谱仪。小型四极滤质器的女士特性和微流电喷射源。结果小足迹(55 35 x 25厘米),低维护和易用性使得它很容易使用行和point-of-need。图片来源:Microsaic系统plc
方法
四摇瓶培养的培养anti-Her2 lgG1 CHO细胞表达发生14天工艺创新中心的有利和不利条件下(CPI)一式两份。
紧葡萄糖限制涉及的有利条件,而不利因素涉及更广泛的葡萄糖限制和增加饲料添加,如表1所示。
天0、3、5、7、9、11、13日和14日,样本是从要分析的文化,通过离心样品进行澄清之前。
表1。实验样本。来源:Microsaic系统plc
|
不利的 |
有利的 |
| 葡萄糖下限(g / L) |
4 |
2 |
| 葡萄糖上限(g / L) |
8 |
3 |
| 饲料添加隔天体积(%) |
8 |
4 |
1。lgG产品分析
过滤后的细胞培养样本注入一种蛋白质一列没有任何额外的样品制备。自动绑定和洗脱蛋白进行使用volatile缓冲区促进直接连接到中期TMProteinlD。
这些不稳定的缓冲也促进了不具约束力的直接观察在绑定和组件和完整lgG洗脱阶段。Post-software处理启用deconvoluting和提取完整的自动化lgG质荷光谱的质量。
2。细胞代谢物媒体监测
亲水相互作用色谱法(HILIC)是用于监测细胞媒体代谢物。这使得手机媒体组件的直接观察样品制备。样本混合缓冲和澄清在注射之前消除沉淀。
与梯度分离样品进行了分析,感兴趣的分析物通过选择离子监测监控(SIM)在负模式。
PoC定量的方法也是评估许可证代谢物浓度来衡量,而无需昂贵的isotopically标签标准。
结果
1。lgG产品分析
lgG的完整的分子量是一个至关重要的理化CQA并建立完整的质量是我的一部分06 b准则分析生物制品。
利用中期®ProteinlD与在线蛋白质分离促进这些完整的监测lgG群众在这些细胞培养。
图2。完整的免疫球蛋白质量测量3,5,7,9,11,13,14天。50 Da不同免疫球蛋白质量的有利和不利条件之间观察到1%的显著性水平。图片来源:Microsaic系统plc
监控lgG群众在14日文化的有利和不利条件显示在图2。在时间点,观察50 Da的平均差之间的不利和有利条件,在1%的显著性水平。
进一步的物种也可以看到额外的质谱峰的质荷光谱,如图3所示。这些山峰lgG碎片造成的,特别是HHL片段~ 122 kDa的质量。
图3。额外峰的质荷光谱可以从蛋白质洗脱后观察到一个列。山峰的免疫球蛋白g产品不同的电荷状态在光谱和他们的位置可以看到模拟免疫球蛋白g频谱覆盖红色。额外的山峰与红色光谱不匹配可以观察和用蓝色突出显示箭头。这些山峰可以分配给群众表明免疫球蛋白片段。图片来源:Microsaic系统plc
进一步监测这些峰的质荷光谱辅助这片段被跟踪相对于主lgG在文化产品,如图4所示。
条件,也见过类似的动力学lgG和122 kDa碎片和这些物种的相对比例似乎都有利和不利的条件下。
图4。跟踪122 kDa的物种(HHL片段)随着时间的推移,相对于免疫球蛋白。图片来源:Microsaic系统plc
2。细胞代谢物媒体监测
监控代谢产物在细胞培养是至关重要的优化细胞的健康和促进效价和产品质量。定期监测的谷氨酰胺、乳酸、葡萄糖、谷氨酸。
这四个代谢物的测量利用PoC HILIC-MS方法提出了在图5中。测量光度分析仪也进行了收购,都包含在图5进行比较。
图5。结果PoC HILIC-MS方法量化lactact,葡萄糖,glutamin,谷氨酸在有利和不利的样本。测量的光度分析仪也显示。误差线代表95%氯瓶测量。图片来源:Microsaic系统plc
一个好的女士和光度分析仪之间的相关性被测量。然而,偏差之间发生不利的女士和光度分析仪测量样品后大约11天。
这种分歧在行为之间的有利和不利条件提出了z得分的热图(参见图6)代表的区别光度分析仪和HILIC-MS测量条件。
这不是目前已知的原因,需要进一步的研究。然而,假设更多的副产品可能出现不利的细胞死亡的样本相对于有利的样本,尤其是附近的细胞培养。
这种增长的副产品可以干扰光度分析。
图6。热图的z分数区别光度分析仪和跨跨度为HILIC-MS测量和条件。大后观察测量之间的偏差∼11天的不利的样本。这是红色区域表示为地图右上角的热量。图片来源:Microsaic系统plc
图7。丙酮酸代谢物概要文件,亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和山梨糖醇对有利和不利的条件。明显差异可以看到不利和有利的条件。误差线代表95%氯瓶测量。图片来源:Microsaic系统plc
图8。热图代谢物的z得分在时间点和条件。集群是欧几里得距离。图片来源:Microsaic系统plc
女士能够监视其他代谢物,它提供了一个非常详细的图片健康细胞培养。在这里,其他六个代谢物也监控与PoC HILIC并行方法,如图7所示。
合成代谢物概要文件显示清晰区分文化发展的有利和不利条件。利用女士促进大量的监测分析物,配上大量的数据的收集提供更全面的细胞培养健康的照片。
收集更多的数据经常会导致最终用户正在承受着更复杂的数据的解释,特别是女士正在使用的时候需要由非MS专家。结果,这些数据的解释是必要的简化使用女士的需要。
简化收集的数据在这些测试中,代谢物的热图(如图8所示)生成,使信息从大数据集的提取是快速和简单。热图展品明显区别时间配置文件之间的条件。
不同行为对苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸整个文化导致这些物种聚集。集群行为也意味着谷氨酸和丙酮酸的行为反对的苯丙氨酸,异亮氨酸,亮氨酸。
结论
使用Microsaic中期TMProteinlD结合一个自动化的蛋白质工作流允许简化测量以及完整的监测lgG直接从细胞培养。
额外使用PoC HILIC-MS试验测量了代谢产物在细胞媒体获得样品制备。之间有良好的相关代谢物的测量和光度分析并行测量获得。
然而,这还需要进一步的研究关于光度分析的偏差接近在不利的条件下的细胞培养。
进一步的自动化样品制备预计将提高测量速度,准确度和精确度。利用定制配置的蛋白质和HILIC也支持使用较小的样本数量和降低流速。
确认
从材料最初由Microsai欧洲杯足球竞彩c系统Plc。原文作者要感谢工艺创新中心(达灵顿、英国)进行摇瓶培养,提供光度测定数据,协助数据解释。
这些信息已经采购,审核并改编自Microsaic系统plc提供的材料。欧洲杯足球竞彩
在这个来源的更多信息,请访问Microsaic系统plc。