原子力显微镜(AFM)能够进行三维测量的表面结构在环境nanometer-to-subangstrom决议和液体环境。这些功能导致突破性的生命科学的进步调查的DNA,蛋白质和细胞。欧洲杯线上买球特别是医药研究涉及到许多应用程序迅速受益于AFM,同时作为一个独立的技术和一个强大的补充当前可用的其他常见的分析技术。 本应用笔记检查如何AFM提供直接的独特功能,个人调查的基因运载工具在高分辨率的水合状态。 AFM历史和方法AFM是最常用的扫描探针显微镜(SPM)的技术。SPM的起源开始扫描隧道显微镜(STM)的发展,1982年,研究人员在IBM,苏黎世。 STM的能力来解决在样品表面原子结构赢得了1986年的诺贝尔奖的发明者。然而,STM只能应用于导电或半导电的标本。扩大绝缘体的研究这种类型的显微镜,原子力显微镜是在合作开发IBM和斯坦福大学在1986年。 AFM扫描是由一个尖端的柔性悬臂在样品表面,同时保持一个恒力(见图1)。 
图1所示。SEM图像(300 x放大)的一个集成的单晶硅悬臂和提示结束半径5到10 nm。 建议通常有一个半径为5到10 nm,尽管这可能取决于提示类型。扫描运动是由压电管扫描器,扫描光栅的翻倒的示例模式(参见图2)。 
图2。原子力显微镜的主要组件的示意图,显示TappingMode操作的反馈回路。 TappingMode AFM和联系模式tip-sample交互是通过反射激光监视的悬臂上split-photodiode探测器。最常用的两种操作模式,是接触模式下AFM和TappingMode™AFM,可以在空气和液体环境中进行的。 在接触模式下AFM悬臂偏转恒定的反馈回路,垂直移动扫描仪(Z)在每个侧面(X, Y)数据点形成的地形图像。 通过维护一个常数偏转扫描期间,保持一个恒定的垂直力之间的提示和示例。虽然接触模式已被证明有用的范围广泛的应用程序,它不是有效相对柔软的样本。另一方面,TappingMode AFM包括振荡悬臂在其共振频率(通常~ 300 khz)和扫描整个表面与一个常数,阻尼振幅。反馈回路保持一个常数均方根(RMS)垂直振幅通过移动扫描仪在扫描过程中,相应地保持一个恒定的作用力形成地形的形象。TappingMode的优势是它通常运作的垂直力低于可能与接触模式,它消除了横向剪切力,会损害一些样品。因此,TappingMode已成为首选技术成像柔软、脆弱,胶粘剂,颗粒表面。 AFM在基因传递的研究基因治疗已逐渐成为一种有效的方法治疗会疾病。 然而,这种形式的治疗面临的主要障碍之一是交付的浓缩遗传物质目标。有两种常见的方法包装DNA基因传递:病毒和病毒。 虽然viral-mediated基因传递的模式是目前最常见的,它就会出现一个病人的免疫反应的激活,这可能消除基因运载工具在使用前和生产其他健康问题。为了避免这些并发症,病毒的车辆制造的脂质体或聚合物越来越被用于封装材料相关的DNA或其他药物。欧洲杯足球竞彩AFM成功地改善这种基因运载工具的开发提供了一个更加清晰的认识过程的DNA凝聚。图3显示了病毒的DNA冷凝,形成不同的关系。 
图3。四个不同的凝聚状态的DNA病毒基因运载工具的研究:NiCl)浓缩带负电2对待云母,b)与0.2毫米NiCl浓缩带负电2c)浓缩带正电,d) Noncondensed。根据形成机制,固化物紧密或瓦解。1μm扫描。 变量在形成过程中导致或正面或负面指控冷凝,产生不同程度的DNA包装。 AFM为调查提供了明显的优势超过其他方法DNA冷凝物。最大的优点之一是AFM能够查看运载工具的结构的水合状态,它将出现在使用。此外,AFM纳米级分辨率,研究人员可以很容易地形象DNA链,看看他们的反应和浓缩特定的聚合物或脂质体。没有其他技术允许单个车辆在高分辨率的直接调查水化状态。例如,有各种粒度技术,产生一个大小分布在大量的冷凝物,但它们不能应用于一个单独的冷凝。目前使用最普遍的技术之一是电子显微镜(EM),提供所需的高分辨率查看个人冷凝物,但是需要大量的样品制备时间和需要干的标本在真空环境。,因为干燥的基因运载工具可能会改变他们的结构,结果是,在最好的情况下,那么有用。在最坏的情况下,这些结果可能有错误,导致无效基因运载工具。
一般来说,AFM应用于基因运载工具的一个解决方案。注入流体细胞,它们附着在衬底,通常云母。车辆在云母表面的电荷。带正电的冷凝物自然云母表面的负电荷吸引,和带负电荷的冷凝物可以吸引带负电荷的云母通过将二价阳离子的解决方案,或者涂料用硅烷形成AP-mica云母。AFM图像然后进行通过TappingMode技术解决方案。虽然简单的准备和执行,因此,AFM能够提供高分辨率对个人DNA冷凝物。 基因传递y使用AFM研究有许多出版AFM-based基因传递的研究。邓拉普和同事研究了冷凝机制的变化超螺旋质粒DNA 5-7kb长度与阳离子脂质、lipospermine (dioctadecylamidoglycylspermine或狗)和阳离子聚合物,表面(PEI)。由此产生的冷凝物被TappingMode成像氯化钠溶液在15毫米。 狗和裴,折叠DNA循环辐射从中央核心是明显的,表明包装折叠循环冷凝的DNA。在图4中,包的DNA可以清楚地看到随着聚合物小球。这部分冷凝形成了一个环形结构的环化一个长方形的冷凝与多个凝结节点。通过不同浓度的狗和裴,完全冷凝的条件也被调查。完成裴冷凝物直径是20到40纳米,而完整的狗冷凝物被发现是50到70纳米。这表明,裴可能比狗更有效的冷凝剂。大小和形态的差异也会影响他们的效率作为转染剂。 
图4。病毒的基因传递与浓缩DNA和聚合物。Orangeviolet小球的表面(PEI)、阳离子聚合物,稳定循环的黄绿色五千碱基质粒DNA循环。不固定的分子成像在15毫米TappingMode盐溶液。 AFM图像也被用于原位动态过程,以便更好地理解的形成机制与DNA凝聚。缩合聚乙二醇聚(amidoamine)的DNA被观察到在实时的水溶液。整体的正电荷polymer-DNA凝析油用于静电带负电荷的云母的冷凝物。然而,它并不是那么严格,防止冷凝物的运动在形成。 固化物的成像解决方案表示环形和棒状冷凝物结构的存在。在图5中,形成一个环形冷凝水可以看到在35分钟的时间间隔。从这些图像,形成的环形结构似乎加入棒状冷凝物的目的。 
图5。形成环形DNA-polymer冷凝超过35分钟的时间间隔。比例尺= 200海里。 进一步的调查显示存在的棒状和环形结构处于一种动态平衡的状态,与棒状的冷凝物改变环形,环形棒状结构。研究实时动态过程可以更好地了解冷凝过程的动力学,这可能导致基因传递的重要改进。 结论AFM在研究纳米尺度已经证明成功,原位DNA结构。这有一个明显的相关性努力开发更有效的基因运载工具。研究人员正在利用AFM-high决议的很多好处,简化样品制备,实时调查,无损成像,和液体的能力来执行调查DNA凝聚机制和各种gene-packaging材料。欧洲杯足球竞彩虽然上面讨论的例子只是一个抽样的工作进行了原子力显微镜在基因传递的研究中,他们表明AFM是多么重要对基因治疗的未来。AFM的独特好处几乎肯定会在基因治疗发展起到至关重要的作用。 |