拉曼成像-电子倍增CCD (EMCCD)辅助下的改进拉曼成像

共聚焦显微镜使用点光源(激光)聚焦在样品上。反射的(荧光)光通常用相同的物镜收集，并聚焦到探测器前面的一个针孔中。这确保了只有来自图像焦平面的光才能到达探测器，这大大增加了图像对比度，并通过适当选择针孔大小，略微提高了分辨率。

在共焦拉曼成像中，如alpha300R系统在这里所描述的实验中，我们使用了特殊的滤光片来抑制反射的激光，同时使分光计/ CCD相机组合能够检测到拉曼散射光。为了获得一幅图像，在很短的时间内获得数千个光谱，每个光谱的积分时间通常小于100毫秒。

随着拉曼散射横截面非常小，激励力量仅限于几毫瓦，如何提高共焦拉曼系统的整体敏感性？

噪音源

优化的重要因素是信噪比（S / N）。第一步是改善收集的拉曼信号。这可以通过优化显微镜和光谱仪的吞吐量以及使用具有高数值孔径（NA）的物镜来完成的。共聚焦设置有助于减少来自焦点外区域的不需要的背景信号，进一步增强S / N。

选择合适的探测器

其次是选择灵敏度最高的探测器，比如背光源CCD，它的量子效率可以达到90%以上。探测器本身的主要噪声源是暗噪声和读出噪声。目标必须是消除所有其他噪声源，以便只留下光子脉冲噪声。

当光子遵循泊松统计时，对于一个给定的信号，其不确定性是电子信号的平方根。在没有其他噪声源的情况下，对于100电子的信号，S/N不能大于10。

黑暗的噪音

暗噪声是由CCD中热产生的载流子引起的，通过对CCD的有效冷却可以显著降低暗噪声。一个好的CCD在-60°C时的热暗电流小于0.01电子/像素/秒。因此，在-60°C以下的冷却对于几秒钟的积分时间是不必要的。

对于积分时间小于100 ms的共焦拉曼装置，暗电流完全可以忽略不计。读数噪声是在将收集到的电子转换为数字计数时产生的，它受到CCD读数放大器的质量以及读数过程的速度(数字化率)的限制。

读出噪声

读出噪声由相机制造商指定，并以电子形式给出。典型值为50kHz读数速率时5-10个电子到2.5 MHz读数速率时约30个电子。

如果读出噪声超过光子脉冲噪声，则称信号受到读出噪声限制。在普通的光谱实验中，人们只需要增加积分时间来获得足够的信号，以确保信号再次受到散粒噪声的限制。不幸的是，这在共聚焦拉曼显微镜中并不总是可能的。

如果一个人获得一幅图像组成的128像素/线和128行只有1 s集成时间/频谱,总收购时间是4,5个小时,这是减少到100 ms的集成时间少于30分钟或者不到3分钟10 ms的集成。不幸的是，读出探测器的速度越快，读出放大器的噪声就越大。

配备50khz读出放大器的1024 × 128像素CCD可以在大约22毫秒内读出，这也是可能的最短集成时间。如果我们假设读数噪声为10个电子，则每一个低于100个电子/像素的信号都将受到读数限制(泊松噪声<读数噪声)。如果快速读出放大器的读出噪声为30个电子，即使是900个电子(探测器上约1000光子/像素)的信号也将被读出有限。

电子倍增CCD或EMCCD

电子倍增CCD (EMCCD)是一种带有额外读数寄存器的普通CCD，其时钟电压比普通CCD读出寄存器高得多。由于这种高时钟电压，通过冲击电离实现电子倍增，信号的可调总放大倍数高达1000倍。在这种设置下，即使使用非常快的读出放大器，也总是可以将信号放大到高于读出噪声的水平，因此信噪比总是受到信号泊松噪声的限制。例如，本文实验中使用的带有2.5 MHz读出放大器的1600 x 200像素EMCCD，读取时间仅为2.3 ms。

Improvi的例子ng信噪比

下面的计算显示了不同信号的信噪比可以预期的改善。假设CCD的量子效率(QE)是90%,而放大的信号被设置为一个价值1 a / D数等于电子数的读出噪声(1 a / D数= 30电子为2.5 MHz读出放大器)。

例1 -没有EMCCD

如果在给定的积分时间内100个光子落在CCD像素上，将产生90个电子并转换为3个a /D计数。读出噪声为1 A/D计数，泊松噪声为9.5，约为0.3 A/D计数。根据这些数字，信噪比约为2.6。

例1 -使用EMCCD

在EMCCD中，信号会乘以高达1000的电子增益因子。放大系数一般要小一些，但在计算上没有什么区别。90个电子将被放大到90000个电子，产生3000个A/D计数。泊松噪声是9500个电子，转换为317个计数，而1计数读数噪声完全可以忽略不计。信噪比为9.5，提高了3.6倍。

例2 -没有EMCCD

如果信号只有10光子，这将导致信号只有0.3计数正常的CCD。泊松噪声在这种情况下可以忽略不计。在1计数读数噪声下，信噪比为0.3，很难检测到信号。

例2 -使用EMCCD

对于EMCCD，信号为333计数，泊松噪声是100计数，其提供3.3的S / N，在正常CCD上提高11倍。

过量噪音和EMCCD

实际上，电子倍增过程本身增加了一个额外的，所谓的多余噪声因子，约为1.4，因此，在上述例子中，信噪比的实际改善分别降低到2.6和7.9。

对于更高的信号，EMCCD不需要

对于更高信号，其中信号强度不再读出限制，EM过程的过量噪声系数将EMCCD的S / N比降低到正常CCD的S / N比。在这种情况下，可以关闭EM寄存器，然后使用“正常”读出寄存器。因此，EMCCD表现正常作为正常的背部照射CCD。

案例研究

聚甲基丙烯酸甲酯薄膜的共焦拉曼成像玻璃衬底

图1显示了自旋涂覆在玻璃基态上的极薄PMMA薄膜的三张共焦拉曼图像。在图像中心，用金属针垂直划痕去除PMMA层。在划痕处用AFM测量的薄膜厚度为7.1 nm。观察到有一个额外的4.2 nm厚度的污染层。这一污染层的来源和物质组成最初并不清楚，但可以通过共焦拉曼测量确定。

图1所示。a-c:在CH2 3000 / cm左右的拉伸带中获得的玻璃上7.1 nm薄PMMA层的共焦拉曼图像。比例尺:10 μm。图1d:样品30 × 50 μm, 100 × 80像素= 8000光谱，110 ms/光谱示意图。

无EMCC的拉曼成像D

通过在50×50μm扫描范围内获得200×200拉曼光谱并集成CH的强度来获得图像₂PMMA拉伸带在3000 / cm左右。激励功率为20 mW @532 nm，使用100x, NA=0.9物镜。图1a是使用标准背光源(BI) CCD，使用62khz读出放大器和36ms积分时间/谱得到的。稍微想象一下，图像中心的划痕是可见的，但信噪比远小于1。

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图1b显示了用EMCCD拍摄的样本的相同部分，其增益约为250。图像显示几乎相同的信噪比，但积分时间仅为3.6ms，比图像1a快10倍。对于图像1a，完整的图像采集需要25分钟，而对于图像1b，只需要3.4分钟。图1c是用EMCCD拍摄的，但现在积分时间与图1a相同。可以清楚地看到划痕，但也有污染，在PMMA和玻璃表面的针状结构，这将在后面讨论。图1d是样品的示意图。

使用油Immersion客观

对于下一个图像，使用样品颠倒，使用具有Na = 1.4的油浸没物镜。集成时间为7ms /频谱，导致总采集时间为5.4分钟（包括后扫描的0.3s /线）。

图2显示了在相同条件下从16倍到1000倍的不同增益设置下采集的12幅图像₂结合拉伸带得到图像。正如我们所看到的，信噪比在大约200倍的增益设置下会显著增加。在此之上，在图像中看不到信噪比的进一步改善。

图2。使用不同设置的EMCCD增益获取的共聚焦拉曼图像的比较。

噪声汇价与EMCCD增益

在图3中，S / N比CH的信号的比率₂PMMA的伸直条带绘制反对EMCCD增益。信号的标准偏差被视为噪声。可以看出，信号增加到300 x的增益，这似乎是最佳设置。高于此值，S / N值再次略微减少。使用适当的增益因子，总体改善超过5倍。

图3。PMMA CH2拉伸带信号的信噪比与EMCCD增益相对应。

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由于辅助深度分辨率有限，所获得的频谱都不是纯PMMA光谱或污染层的纯光谱。然而，通过在没有污染的情况下平均在划痕区域中获得的所有光谱，获得纯玻璃谱。通过随后从PMMA谱除以玻璃谱，以及从污染的光谱，可以计算纯PMMA和污染光谱。将这些光谱进行基础分析，其中每个测量的光谱装配为基本光谱的线性组合。使用该技术，可以获得三个具有三种组分（玻璃，PMMA和污染）的图像，其被彩色编码（蓝=玻璃，红色= PMMA和绿色=污染）来可视化它们的分布（图4）．图。图5示出了不同组件的光谱。为了更好地进行比较，它们以相同的最大强度显示。相对于玻璃光谱，PMMA光谱被放大了约20倍，污染光谱被放大了约15倍。

图4。玻璃上7.1 nm PMMA层(红色)和4.2 nm污染层(绿色)的彩色编码共焦拉曼图像(蓝色)。200 x 200光谱，7 ms积分时间/光谱。总采集时间5.4分钟。

图5。从图4的拉曼测量计算出的拉曼光谱，显示出相同的最大强度。这个刻度只适用于PMMA。相对于玻璃光谱，PMMA光谱被放大了约20倍，污染光谱被放大了约15倍。

识别污染物相

由此，绿色光谱(污染)可以很容易地识别为烷烃。样品在拉曼测量前几周准备用于AFM厚度研究，并储存在聚苯乙烯(PS)容器中。这些PS容器是由注射成型和烷烃是用来涂层模具更好的分离。当样品被储存(可能是在温暖的环境中)时，部分烷烃蒸发并在样品上凝结，这就解释了针状结构以及涂层也覆盖了划痕的事实。

优化结果

图5中的刻度为PMMA对PMMA的尺度是正确的，并且最多仅显示28个计数。通过完整的CH平均信号₂拉伸方案（约330 / cm或150像素）是1965年计数。该测量的EM增益约为600×，因此1965年计数对应于仅99个电子（110个光子）总量和每CCD像素最大值的1.4光子！但是如何使用这么少的电子获得良好的拉曼光谱？

原因是，平均约20,000个光谱以计算图5所示的PMMA光谱，因此整体信号倍数为20,000倍。但是，只采用这些光谱，其中存在PMMA。为此，每光谱的信号必须足够强以显示在拉曼图像中PMMA的分布，因此可以选择对平均的正确光谱。可以看出，每个EMCCD像素的1.4光子足以在该示例中可视化PMMA层的分布，并为平均过程选择右谱。

如果在CH中没有背景信号的衬底，结果会更令人印象深刻₂应该采用拉伸的方法。图6显示了玻璃、烷烃和PMMA在相同强度尺度下的三种光谱。可以看到，使用的玻璃衬底有一个小的拉曼峰，大约有一半的PMMA信号和大约三分之一的烷烃信号恰好在这个区域。显然，拉曼系统的共焦性对薄层的可探测性至关重要。

即使使用最好的共聚焦装置，信息深度至少是500 nm，这意味着500 nm的玻璃对拉曼信号有贡献。由于拉曼信号与材料的数量成正比，一个标准(非共焦)设置将收集300倍以上的玻璃信号(170 μm覆盖玻璃厚度)，使薄涂层的检测是不可能的，即使有更长的积分时间。

图6。谱图与图5相同，但比例正确。

总结

结果表明，使用EMCCD相机可以大大提高检测效率和速度，特别是对于短积分时间所需的共聚焦拉曼显微镜。7.1 nm PMMA的分布以及4.2 nm烷烃层玻璃衬底上可以很容易地发现和确定的积分时间只有7 ms /频谱,这降低了整体收购时间5.4分钟为200 x 200(= 40000)共焦拉曼光谱图像。

对于很小的信号由CCD´s读出噪声、EMCCD的使用可以提高信噪比的5 - 10倍比最佳可用标准CCD´s,而对于较大的电子信号相乘电路可以被关闭,所有属性的标准(背景)CCD维护。

此信息已从WITec GmbH提供的材料中获取、审查和改编。欧洲杯足球竞彩

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