目前的抗菌药物在不久的将来可能会因为一种叫做耐药性的现象而失效。这是指微生物抵抗抗生素引起的杀菌(杀死细胞)或抑菌(抑制生长)作用的能力。众所周知，细菌通过进化过程获得耐药性，这是由抗生素的广泛使用和滥用驱动的。如果不解决这一公共卫生问题，各种传染病可能会变得不可治愈。药物对微生物的作用机制迄今尚不清楚。许多问题仍有待回答:为什么药物不再有效?我们怎样才能选择更好的呢?我们能减缓耐药细菌的发展吗?
万古霉素是一种糖肽类抗生素，作用于革兰氏阳性菌，如葡萄球菌、链球菌和肠球菌。它特异地与肽聚糖前体的末端D-Ala- D-Ala结合，阻止了肽聚糖合成的两个主要步骤——转糖基化和转肽化，最终导致细胞裂解。原子力显微镜(AFM)已经显示出它在药理学领域的优势，提供了药物与靶标相互作用的相关信息。该技术也可用于测量单个生物分子之间的皮牛顿力灵敏度解绑定事件。
在本研究中，Vancomycin改性技巧用于测量万古霉素/ D-ALA-D-ALA相互作用的力和动力学。这些测量是在模型底物以及活乳乳球菌乳酸菌细菌上进行的。
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图1。使用模型底物测试功能化AFM针尖的结合特异性
样品制备
细菌从指数生长的培养中收获，在缓冲液中重悬，并固定在多孔聚碳酸酯膜上。利用Veeco多模AFM获得了接触模式图像和力距离曲线。采用Veeco公司的三角形氮化硅悬臂梁进行测量。对于力的测量，最大施加的力保持在250 pN，以减少压痕。亲和图像是通过记录16 × 16的力距离曲线阵列，并计算每个在一定面积上的粘附力得到的。悬臂梁的弹性常数为~0.011 N/m。
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图2。合成载体上万古霉素与D-Ala-D-Ala相互作用的单分子力谱。金探针被双(万古霉素)半胱胺功能化，而金载体端接OEG和OEG丙酸部分与D-Ala-D-Ala多肽共价反应。(A)在万古霉素尖端与D-Ala-D-Ala支架之间的PBS缓冲液中获得具有代表性的力曲线和粘附直方图(n = 978)，重现性高。(B)游离D-Ala-D-Ala多肽的对照实验，粘附频率显著降低。(C)在保持相互作用时间和接近速度不变的情况下，缩回过程中黏附力与加载速率对数的关系图(每个数据点100次测量)。(D)在保持接近和缩回速度不变的情况下，粘附频率作为相互作用时间的函数图(每个数据点100次测量)。
表1。图1描述了化学策略，并总结了测量的实验数据并据此推断
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使用Vancmycin提示动态力光谱
力距离测量测量在合成载体上确认了万古霉素和D-Ala-D-Ala之间的单一和特定粘附力。动态光谱数据显示了慢束缚过程。发现该事件的平衡解离常数为0.4mm，即高于先前的研究。这可以通过围绕万古霉素和D-Ala-daLa肽的空间障碍效应来解释，这可以改变识别过程。
在生物细菌上映射未绑定的事件
如图3所示，我们使用万古霉素针尖绘制单个D-Ala-D-Ala肽在活乳酸乳球菌上的分布。力曲线记录显示，约12%的病例出现了解绑定事件。与之前在平面支架上的实验相比，粘附力直方图(n = 1536)显示了一个双峰分布，最大的粘附力在83±22 pN和150±16 pN(图3C)。第一个峰与平面支撑上的峰(~98 pN)接近，被认为反映了单次相互作用。另一个峰可能反映了合作结合，这是万古霉素常见的现象。这种相互作用的特异性被一种突变菌所证实，该突变菌产生以D-Ala-D-Lac结尾的肽聚糖前体，而不是D-Ala-D-Ala。
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图3。生物细菌对D-Ala-D-Ala位点的成像和探测。（a）AFM图像显示在verlaria细胞中的单个wt乳乳杆菌纬度被捕获到多孔聚合物膜中，特别适于在分裂过程中适用于非侵入性和原位成像。被隔膜区域以及环状结构被认为是富含新合成的肽聚糖（白色盒子）的富含。（b，c）粘附制图和粘附力直方图（n = 1536），具有在隔膜区域的万古霉素提示和活细菌之间记录的代表性曲线。（D，e，f）在突变细菌上进行的相同实验，其表现出D-Ala-D-Lac结束代替D-Ala-D-Ala，导致粘附绘图的粘连事件的壮观降低，并且在直方图上。
总结
用抗生素修饰的探针测量单分子AFM力，可以测量抗生素的解合力，并在活细菌上绘制相应配体的图谱。力谱测量可提取相关参数，提供药物-靶相互作用的特异性和动力学信息，对新药的开发和改进有很大帮助。
确认
该工作得到了国家科学研究基金会（FNRS），TheUniversitéCaturededeLouvain（FondsSpéciauxdeChercherche），科学，技术和文化事务（吸引力计划的环境极）和奥地利科学基金会欧洲杯线上买球（项目P-15295）。在J. Errington的实验室工作由BBSRC获得资助。我们感谢L. Piraux用于使用热蒸发器，E. Ferain用于使用扫描电子显微镜。y.f.dufrêne和p.hols是FNRS的研究伙伴。刊登了美国化学学会的许可。
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