原子力显微镜检测细胞形态学的变化的突变杭丁顿蛋白利用Veeco放映机II AFM仪器

原子力显微镜(AFM)是通过扫描一个尖端,支持在一个敏感的电阻值悬臂,样本,从而产生表面的三维图像。提示扫描整个样本,与表面相互作用的变化改变垂直偏转检验的小费。这些变化在偏转通过光学检测方法进行监视。一个反馈控制系统响应这些变化通过调整tip-sample距离为了维持一个恒定的偏转。这是垂直运动的技巧用于生产的地形图像表面。联系方式和TappingMode™已经证明了他们的高价值在生命科学的应用,特别是在过去的5年。欧洲杯线上买球

AFM最近的高分辨率成像能力促进原子模型的构造地形图像的超分子组装光合蛋白和通道蛋白。此外,已经取得了很大的进步在使用AFM对活细胞成像。其中最引人注目的AFM在生命科学领域的进步,然而,是力量的应用光谱学研究near-physiological条件下对活细胞。欧洲杯线上买球

力光谱学允许调查单分子识别过程,细胞动力学和力学性能在高空间分辨率和高灵敏度。最近,AFM力的研究已经成功地应用于研究神经退行性疾病如阿尔茨海默病和亨廷顿氏病。

结合原子力显微镜和光学显微镜

进行AFM力光谱学实验本质上是一个统计过程。因此,这些研究往往需要执行许多控制实验为了自信地观察交互属性感兴趣的特定绑定的配体和受体。通过AFM与光学显微镜相结合,我们可以克服这些问题和提供新的特性比如identifi阳离子和本地化的分子/受体感兴趣的和有针对性的力测量。

原子力显微镜在亨廷顿氏舞蹈症特征

在本文中,我们将关注亨廷顿氏舞蹈症,进步的常染色体显性遗传疾病,是由扩张的谷氨酰胺的杭丁顿蛋白(计画),导致精神,运动和认知障碍。底层机制造成这种疾病的原因仍不清楚,尽管提出了多种病理机制。

受到多麸醯胺酸在所有障碍,亨廷顿氏病病理特征是受到多麸醯胺酸的蛋白质含有细胞内聚集。这里我们使用的独特功能放映机™II加上倒置光学显微镜进行活细胞研究的细胞效应引起的突变杭丁顿蛋白组装在细胞内蛋白质聚合。我们还将突出我们的工具的成像功能,尤其是AFM和细胞荧光成像技术的结合。在这个由两部分组成的系列文章的第二篇论文在神经退行性疾病的原子力显微镜,我们将强调放映机II的力谱功能。

CHO-K1细胞的制备

CHO-K1细胞转染与YFP-tagged杭丁顿蛋白第1外显子片段(HttexQ68-EYFP, 1 - 90;68 polyglutamines)。转染了使用2 x10⁵细胞,1µg质粒DNA和3µl Fugene高清(罗氏)。随后,细胞被播种在无菌盖滑(18 x18毫米)6-well盘子。24-48h孵化后细胞被洗两次与PBS和fi xed 4% PFA 10分钟。

Brightfield (BF)、微分干涉对比(DIC)和数字化的图像记录使用蔡司Axio观察者配备AxioCam MRc相机和AxioVision软件。AFM图像都记录在Veeco放映机II使用MLCT和DNP-20悬臂。系统结合AFM和光学测量作为一个完全集成的工具。所有实验都是在接触和TappingMode™在PBS缓冲。3 d-rending AFM的高度进行图像,使用Veeco视觉软件包。

注册和AFM和光学数据的相关性

适当的登记和AFM和光学数据的相关性,有能力至关重要光学视野内的AFM尖端对齐,以及位置提示样本相对于感兴趣的一个地区。

手动和电动XY-translation阶段的可用性在放映机II提供了一种简便而有效的方法技巧/光学和提示/样本对齐。从低magnifi阳离子——这提供一个更大的存在误伤的样本和AFM冰山的位置-杭丁顿蛋白总量显然是被各种光学对比技术;在高炉epifl uorescence YFP-tagged基于强烈的荧光信号介导的计画,计画在DIC总量的基础上,改变细胞拓扑。

我们从定位开始AFM提示在视场的中心使用手动x - y翻译阶段(重要当切换到更高的放大,因此小视野)。然后我们使用电动舞台位置感兴趣的区域相对于小费。这种方式提示和感兴趣的地区通常的中心视野。

在图1中,我们展示了一个例子,这样的状况:图片1 a和1 b显示了BF和所选区域的荧光图像,分别,但悬臂不是位于这显示窗口(尖的形状是可见的在图像右下角1 a)。先后使用手动和机动阶段,它非常容易移动顶端略高于感兴趣的区域。

图1所示。进入感兴趣的领域使用“导航”功能。(光明存在误伤图像)和B (fl uorescence图像),感兴趣的计画一些明亮的总量是可见的,但建议是远离样本和存在误伤的视图(见影子图像的右下角)。用X, Y运动螺丝和操纵杆允许放置的提示在感兴趣的领域(C和D,明亮的存在误伤和fl uorescence图像,分别)。光学图像获得20 x的目标。

定位技巧和感兴趣区域的中心光学的视野也将有助于减少一些光学畸变/扭曲效应可能影响图像配准的精度。这些畸变(彩色和球形)接近的外边缘更为普遍存在误伤的特定目标和最小/光轴。

提高原子力显微镜的准确性

放映机二世的机动阶段的设计是非常稳定的,和艾滋病在获得高度精确的图像。的三个马达螺丝放映机二世不旋转,与大多数AFM的;相反,汽车螺丝连续移动的头。这提供了一种“不动摇”方法的AFM,有助于准确定位感兴趣的区域的样本在参与过程中。的毫微秒示波器®V控制器的软件自动化与过程提供了一种快速但安全提示在样品表面的接触。——这是至关重要的,当成像软样品保存样本和AFM小费。

图片1 c (BF)和1 d(荧光)拍摄的方法过程的最后一步。有趣的是,红外激光用于AFM检测没有扰动对高炉的影响或数字化的图像。红外超发光二极管不干扰红色生物荧光团。在850海里,也可以轻易过滤如果一个客户有一个IR-sensitive相机,想删除观察的总计AFM提示从他们周围的激光光学图像。

图2是一个直接的例子类型的研究,通过结合AFM和荧光成像。图2 a、2 b和c,男朋友相对应,DIC,分别和荧光显示突变杭丁顿蛋白的聚集。图片中的箭头指示的具体总选择与AFM扫描提示而红中概述的地区指定了AFM扫描区域的小费。2 d图像显示的三维地形AFM图像细胞内列出地区相应的光学图像。

图2。使用光学显微镜AFM生成额外的信息。突变YFP-tagged计蛋白质形成明亮的总量(图像,明亮的存在误伤和B, DIC,形象C,这项工作,黄色箭头)中也很容易识别的AFM地形通道(图片D,红色箭头)。此外,细胞拓扑变化引起的聚集造成的其他细胞子结构类似也可以检测到的AFM扫描(D形象,绿色箭头)。与20 x光拍摄的图像目标。AFM扫描:90 x90x3µm。

杭丁顿蛋白聚合的光学显微镜观察到(黄色箭头)也很容易观察到的AFM图像(红色箭头)。虽然存在各种AFM表面的细胞很容易观察到AFM,地形成像还不足以让你区分不同类型的聚合物(除了YFP-tagged总量影响其他细胞子结构单元拓扑发现在AFM扫描(图片2 a、2 b和2 d绿色箭头))。结合光学显微镜AFM,存在/没有荧光信号相关荧光图像允许一个准确地识别如果杭丁顿蛋白的聚合是由蛋白质。

注意,一些细胞表现出均匀荧光细胞染色是由于可溶性杭丁顿蛋白的存在在整个细胞的细胞质中。相比之下,突变杭丁顿蛋白蛋白质本地已经积累总量表现出很强的荧光,因此容易识别。

使用各种目标图像采集与放大范围从20 x 100 x,以及高数值孔径100 x TIRF目标。然而,由于强烈的杭丁顿蛋白总量的荧光强度,最佳结果20 x数字化的目标。

横截面分析-杭丁顿蛋白总量非常异构

完成一系列的实验后,在毫微秒示波器软件执行截面分析揭示了杭丁顿蛋白总量非常异构在大小和形状,从几百纳米到几个微米直径(~ 4µm)。摩擦图像(数据未显示)透露骨料之间的对比和大量的细胞。

相位图像,在TappingMode收集(数据未显示),也表现出了一个有趣的相衬的区域聚集。相对相位变化(或相反)在样本往往表明表面性质的差异,如粘弹性或静电电荷分布。因此,区域对应于骨料相衬会表明他们是由不同的材料或组件比周围的细胞表面。

我们也调查了杭丁顿蛋白的细胞表达野生型形式(数据没有显示)。在这种情况下,杭丁顿蛋白蛋白质仍然是可溶性的,因此,没有变化的细胞拓扑由杭丁顿蛋白总量被检测到。

总结

在目前的研究中,放映机II的成像能力结合荧光显微镜定位和图像突变杭丁顿蛋白的蛋白质总量,亨廷顿氏舞蹈症的特有标志。这个应用程序显示的高选择性和准确性结合系统3 d分子生物系统的识别和调查他们的物理性质通过光学成像和地形,摩擦,粘弹性,附着力测量。这种技术将广泛应用在综合功能分析nanomolecular复合物在活细胞及其相关性疾病发病和进展以及测试药物发现的新化合物的生理效应。

这些信息已经采购,审核并改编自Veeco提供的材料。欧洲杯足球竞彩

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