用生物镜II AFM表征多巴胺与D1受体之间的相互作用

除了高分辨率的成像能力之外，原子力显微镜（AFM）还出现为测量生物分子复合物的纳米力学性能和相互作用力的强大工具。虽然这些类型的AFM研究是在分离的分子上进行的，但对于真正的生物相关性，这些调查应理想地在活细胞系统上进行。

此外，为了同时收集两种类型的数据，现在看来必须能够将AFM与光学显微镜等其他技术结合起来。到目前为止，很少有研究是基于AFM和倒置光学显微镜的结合。

在本研究中，我们研究了力测量在监测多巴胺D1受体在多巴胺刺激下的反应和结合特性方面的潜在应用。我们使用我们完全集成的BioScope II AFM和epifluorescence系统来关联荧光成像和AFM力测量。

多巴胺在中枢神经系统中的意义

多巴胺（DA，4-（2-氨基乙基）苯-1,2-二醇）是属于儿茶酚胺家族的主要神经递质，基于称为酪氨酸的芳族氨基酸，是两个主要激素的前体：肾上腺素和诺拉肾上腺素。

多巴胺与D1受体的相互作用

在外周神经系统中，多巴胺的主要作用是调节心血管功能作为耐药性，激素周转，肾功能，血管流动和胃肠动机。在中枢神经系统（CNS）中，多巴胺参与了运动功能，认知，情感，食物摄入和内分泌调节的控制。CNS中多巴胺能神经递质的功能障碍与各种神经精神疾病相关联，包括Tourette的综合征，帕金森病，精神分裂症，偏执狂和注意力缺陷多动障碍（ADHD）。多巴胺受体分类为D1至D5，其中D1和D2受体构成最大比例。对于这些疾病的治疗，多巴胺能药物缺乏副作用的鉴定是神经元研究和药物发现中最大的挑战之一。

在该特定的研究中，我们使用了YFP标记的跨膜D1受体来研究该受体与多巴胺改性的AFM尖端之间的相互作用的特异性，使用我们的集成工具的力光谱和光学成像特征。

样品制备

用YFP标记的多巴胺D1受体（DRD1-EYFP）转染SH-SY5Y细胞。通过使用细胞悬浮液（10⁶细胞/ ml），4μg质粒DNA和100​​μl转染缓冲液（Amaxa）。随后，将细胞接种在6孔板中的无菌盖板（18x18mm）上。用10-50μM多巴胺盐酸盐刺激表达DRD1-EYFP的转染粘附细胞后48小时。

Brightfield (BF)、DIC和epifluorescence图像在装有AxioCam MRC相机和AxioVision软件的Zeiss Axio Observer倒置显微镜上采集。所有AFM图像都记录在Veeco BioScope™II上，该设备已与光学显微镜完全集成，并使用DNP/ MSCT悬臂梁。

功能化多巴胺悬臂梁的制备

所有实验均在接触和TappingMode™中进行，使用PBS缓冲液和最柔软的DNP-和msct型悬臂梁(名义弹簧常数分别为0.06 N/m和0.01 N/m)。如前所述，制备了多巴胺功能化悬臂梁。

简而言之，使用具有氨基反应末端和硫醇反应性的聚乙二醇（PEG）衍生物作为接头，作为惰性背填充分子，使得只有多巴胺可以有助于观察到的结合相互作用。使用VeeconanoScopt®控制器的热调谐选项在刚性支架上（培养皿的玻璃底部）在流体上计算出春季常数，使用集成的Picoforce软件功能手动更新偏转敏感性。总共有3072个力曲线在3到3.5Hz之间的扫描速率下记录在力体积模式下，并且缩回延迟10ms。扫描区域为2x2μm。

利用AFM追踪多巴胺结合到膜结合D1受体

过表达yfp标记的D1受体主要定位于质膜，在神经元SH-SY5Y细胞中呈随机分布。基于荧光数据，受体在多巴胺刺激下内化到细胞质中。为了支持这一假设，并测试AFM的潜在应用，我们使用BioScope II力谱功能来跟踪DA与膜结合D1受体的结合及其随后的内化。

首先，如图1所示，用多巴胺模拟物对DNP悬臂梁功能化。在接下来的步骤中，活细胞暴露于10 ~ 50 μ M的DA浓度，以刺激D1膜受体。

图1．在活细胞上研究配体和受体的相互作用。AFM尖端以这样一种方式功能化，多巴胺(DA)与d1受体相互作用的化学部分被保留。此外，间隔体的长度使尖端对相互作用本身的影响最小化。

记录外显荧光图像和时间推移片，检测D1受体荧光信号分布的变化，从而研究yfp标记的多巴胺D1受体的内化和结合特性。

图2a显示了t的实验₀:此时，多巴胺未被施加，D1受体未受到刺激。因此，yfp标记的D1受体仍然与细胞膜结合，在细胞表面显示出均匀的荧光染色。DA刺激d1受体后，荧光分布发生显著变化。图2B显示了在t时刻记录的图像的一个典型示例_10min.．所有浓度的DA在孵育10分钟后均未检测到膜荧光。

图2.．相关荧光成像和AFM力测量。在AFM探针上标记DA模拟物，跟踪yfp标记的d1受体在应用自由DA前后的位置。在被DA刺激之前，受体是细胞膜结合的，因此荧光分布在细胞表面(A)，力曲线显示了高比例的特异性解除结合事件(c)。应用DA 10分钟后，所有的荧光都集中成小点(B)，没有具体的事件被记录在强力量中，证明所有的受体已经内化到胞质中。

相反，观察到多个大小和亮度不同的细胞内荧光小泡，表明可能的受体内化(图2B)。这一观察结果表明，在SH-SY5Y细胞模型中，配体DA与D1受体的活性结合。请注意，微弱的荧光信号要求我们使用较长的曝光时间来获得荧光图像。为了避免可能的漂白效应，我们在使用DA时关闭了荧光快门，在获取图像之前打开了荧光快门。

除了荧光成像之外，在存在和不存在多巴胺的不同时间点，在生物细胞上使用AFM力体积模式记录DA-D1受体未粘附力。在时间点T具有DA官能化尖端的单个电池的力量成像₀(没有d1受体的刺激)导致了相当一部分(13.12%)的力曲线表现出特定的解结合事件(图2C)。

在光学观测的同时，力的测量也在时间点t进行_10min.（通过DA刺激D1受体）。如图2D所示，所有记录的力曲线都没有表现出特定的未粘连事件，从而通过荧光成像来支持D1-受体内化到胞浆中的观察结果。即使在1小时的DA刺激后，我们也没有发现这种现象是可逆的。图像和时间流逝电影的比较证实观察到的荧光模式的变化是内化过程的直接后果。

结果分析

在我们的研究中，DA - Di受体相互作用在约223±82 pn左右呈现单个未粘附力。有趣的是，当在细胞的边缘测量时，平均峰值是稳定的，而观察到最强的变化和更高的值以进行细胞核附近拍摄的测量。迄今为止，多巴胺与其受体之间的相互作用机制尚未完全理解。研究报告了多巴胺的药物特征，以及其许多激动剂和拮抗剂到其潜在受体。根据受体类型，发现解离常数在880和2980nm之间。

动态力光谱法测定动力学参数

动态力光谱也可用于测定动力学参数。在我们的工作设置中，所有AFM扫描都在相同的条件下进行，但也可以改变扫描参数并根据装载速率绘制解除力。曲线进展可以提供信息的IF动力学是否更依赖于能量景观的内部或外屏障。动力学非速率常数（k_离开)也可以确定。

基本上，根据缩回期间作为载荷速率的对数的函数绘制粘附力，同时保持恒定的相互作用时间和接近速度，将揭示能量屏障的长度比例。在力零时曲线的曲线的额外组织将给予k_离开．

另一方面，根据相互作用时间的函数绘制粘附频率，同时保持恒定的方法和收缩速度将提供相互作用的结合概率所需的相互作用时间。最后，了解协会率常数（k_在)时，平衡常数可确定为:K_D= K._离开/ K_上。

总结

本研究表明，组合AFM和荧光显微镜的电位，以研究活细胞表面上的多巴胺D1受体的存在和结合性质。在这个两部分系列的关于AFM在神经退行性疾病研究中使用的说明（参见AN117：第I部分）实验，重点是生命科学应用中使用的两种主要技术的集成。欧洲杯线上买球将光学显微镜技术与Bioscope II AFM相结合：

1. BF，DIC，荧光和AFM高度图像感兴趣分子的3D鉴定。
2. 通过光学成像和地形，摩擦，粘弹性和粘附数据研究靶分子的物理性质。
3. 亚微米尺度的蜂窝信令事件实时观察。
4. 测量配体及其受体之间的规格C不矛盾，并且在等方面测定它们的动力学参数。最后一个选择在药理学的巨大选择中开辟了巨大的可能性，尤其是药物发现。

通过将光学显微镜与Biocupe II的AFM能力相结合，这不仅为用户提供了在单一实验中的两种技术的好处，它还可以轻松访问样本和高度操纵的灵活性。我们认为，这些研究提供了令人信服的结果对这种多峰仪器的价值，并有助于速度进展神经病学研究。

这些信息已经从Veeco提供的材料中获得，审查和改编。欧洲杯足球竞彩

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