使用扫描电子显微镜和地图集对生物样品的高分辨率成像

当前生命科学研究中的主要有远见目标之一是获得了哺乳动物大脑复杂神经回路的数字3D重建。欧洲杯线上买球为此，通常需要在纳米分辨率下成像大量的超大核横截面。用于成像生物样品的广泛使用的透射电子显微镜（TEM）在小型成像场内提供了出色的分辨率。但是，相当复杂的操作和图像的大小有限，导致效率差，并增加了以高分辨率成像大面积所需的时间。

为了解决高速获取大量高质量串行图像的挑战，卡尔·齐斯（Carl Zeiss）最近开发了一种新颖的方法：“”Atlas™” - 用于自动大面积扫描的模块。ATLAS™结合了扫描传输电子显微镜（STEM）成像模式（或实际上任何其他检测方案）的现场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）以及极较大的数字扫描发生器和图像采集系统，最多32 K××32 K像素。基于FE-SEM的STEM成像与ATLAS™的组合，一个大型标本室，舞台运动，多个网格样品持有人以及Carl Zeiss Fe-Sem上可用的高度自动化功能是传统TEM成像的非常引人注目的替代品。

给定合适的样品，可以在几天内执行无人值守的操作。相应的申请程序将在此处介绍和介绍。

ATLAS™的主要功能

Atlas™的主要功能包括：

• 在FE-SEM中选择不同成像任务的不同检测器（包括TEM等效图像的​​STEM检测器）时，完全灵活性。
• 高度自动化的多站点图像采集过程可以根据需要进行自动舞台运动，焦点，污名，亮度和对比度调整，以实现无人看管的操作。
• 智能扫描旋转记忆和平铺机制可确保串行截面的对齐方式并在网格中高分辨率以及网格中的高分辨率采集多个图像。
• 使柔性图像大小从1 K×1 K到32 K×32 K像素。
• 量身定制的查看器软件可有效处理多gabyte图像。
• 易用性以及高效输出。

场发射扫描的最大光束能量显微镜

在Fe-Sem中，与茎检测器的超小观体横截面的成像与TEM中的图像记录非常相似，因为可以收集未散装的电子（Brightfield模型）和散射的电子（Darkfield Model）。但是，FESEM中的分辨率仅受到光束尺寸的限制。在Fe-Sem中，样品下方没有透镜消除了由于能量损失而引起的散射角和铬畸变引起的球形畸变。在FE-SEM中，最大光束能量通常限制为30 kV，并且不需要CCD或胶卷摄像头。

Fe-SEM的最大光束能限制了主要取决于材料组成的最大束穿透深度。重金属染色材料（例如生物样品）是Fe-S欧洲杯足球竞彩em中低压茎的理想候选物。

现场发射扫描的特征

FE-SEM具有数字扫描发生器和像素像素图像采集系统，与TEM中的CCD或胶片摄像头相比。使用FE-SEM的一个好处是，现代数字采集系统可以提供极大的范围，并且对于Atlas™，在单个图像中大小。

TEM的典型大型CCD摄像头仅提供2 K x 2 K，框架商店的尺寸具有较大的格式，只能以大幅提高的成本提供。

从FE-SEM获得的更大，高质量的数字扫描图像转化为更有效的瓷砖，以覆盖非常大的区域。但是，对于在2或3 nm像素分辨率下提供60至100微米的视野，可能不需要平铺。

图。1。Zeiss多模式茎检测器中Brightfield（BF）和Darkfield（DF）二极管的独特布置。可以同时收集BF和DF电子并一起处理。BF倒置DF是用于超过100微米的大型视野的典型配置，并具有均匀的照明。

茎模式下的分辨率可能高达0.6 nm，而Fe-SEM接近TEM和茎图像质量实际上可能超过某些方面的TEM（例如对比度）。一些示例显示了以下词干模式下的Fe-Sem可以轻松实现的图像质量。

图2。10 nm免疫金的茎图像在Lowicryl HM20环氧树脂中标记大鼠下丘脑，无染色。

图3。未染色的大鼠海马超截面中的髓鞘轴突鞘的茎图像，其间距为3 nm。

ATLAS™ - 任意扫描生成器和数字图像采集系统

这Atlas™是一种任意扫描发生器和数字图像采集系统，能够单图存储高达32 K×32 K像素。ATLAS™提供了对梁挠度，停留时间（100 ns增量）以及更高级别过滤和分配算法的精确控制。在ATLAS™软件中，完全控制了整体镶嵌宽度，高度，像素大小，瓷砖分辨率和瓷砖重叠。

此外，ATLAS™还可以控制FE-​​SEM自动功能，例如自动对焦，亮度和对比度，梁污名和扫描旋转记忆，以确保纳米分辨率和高度尺度上的高图像质量。对于图像的实时询问，重复特定图块甚至电子邮件服务器，还有其他功能，用于向远程用户进行进度更新。

图4显示了可以将其扩展到12个样本支架（顶部），TEM网格（中间）的图片和一个formvar涂层插槽网格的多样品旋转木制支架，其中具有17个串行超级截面（底部）。样品下方的DF和BF探测器的放大倍率非常低，分别是深色横形和右图像中心的明亮圆圈。

图4。多样品旋转木制支架，TEM网格旋转木马支架和带有17个串行超级截面的FormVar插槽网格的图像。

设置并运行典型的ATLAS™作业

典型Atlas™可以在几个小时内设置工作，然后在几天内无人看管。马赛克选项面板允许定义镶嵌参数和自动功能。如图5所示，可以根据要执行的作业的要求，在初始设置过程中选择镶嵌尺寸，单图金像素大小，单图块分辨率，停留时间和重叠区域大小等。通常，ATLAS™的应用程序如下：

• 将样品加载到FE-SEM中。从ATLAS™用户界面中选择“创建马赛克”，然后选择“马赛克批处理处理”，包括“舞台位置”，“马赛克参数”和“自动功能”等。
• 根据要求定义马赛克作业参数后，图像采集将自动从单击“执行”开始。
• 具有高像素分辨率的生成的图像图块可以通过集成的查看器软件来处理和缝制。
• 可以通过所需的分辨率查看和导航缝合的马赛克，输出和保存。

图5。镶嵌选项面板显示任意参数设置和自动功能。

图6显示了一个典型的单位位点6×2马赛克，覆盖一个250微米宽的超截面。12个瓷砖中的每个瓷砖都有一个48微米的视场，单个24 K×24 K像素图像显示2 nm像素分辨率。

图6。用茎检测器记录的大鼠海马的超小感横截面的6×2镶嵌图像。

图7。来自24 K×24 K像素的单个图块的大鼠海马变焦图像。

单个图块的高像素密度可以通过连续缩放可视化。如图7所示，来自单个24 K×24 K像素瓷砖的模拟缩放说明了极端的视场像素密度能力。使用10百万像素的TEM相机，将需要300多个图像以等效的像素分辨率覆盖该区域，这也导致了后图像处理过程中相应的工作量更大。

多个站点和多个网格

可以在单个网格中进行多个站点，并在多个网格的多个站点上重复图8中所示的12个赛车架的多个站点。站点选择是手动完成的，并由操作员在自动运行之前执行。每个站点的简单扫描旋转记忆可确保在网格中的串行部分对齐以及网格与网格的对齐。

图8。在“SmartSem®”的舞台导航中，多旋转木马支架的配置。

软件

自动化作业完成后，可以通过集成的查看器软件将生成的图像瓷砖查看并缝合在一起，以获取大面积的全景图像。查看器允许用户有效地打开，针迹，导航，输出/保存，并明智地重新渲染ATLAS™生产的大型二维数据集。

概括

基于FE-SEM的STEM成像与ATLAS™结合使用是一种新的高分辨率，高吞吐量成像技术，可用于组织样品，为生物样品的传统TEM成像提供了替代方案。您不再仅限于以高分辨率成像样品的一小部分。在这里，基于Fe-Sem的STEM与ATLAS™结合使用，是大量图像采集的优越解决方案。

致谢

我们感谢Doug Wei博士和他的团队在ATLAS™开发中的开创性想法和全力支持。

德克萨斯大学奥斯汀分校学习与记忆中心约翰·孟德霍尔（John Mendenhall）因提供样本和重大讨论而感激不尽认可。

此信息已从Carl Zeiss显微镜GmbH提供的材料中采购，审查和调整。欧洲杯足球竞彩

有关此消息来源的更多信息，请访问Carl Zeiss显微镜GmbH。