治疗性单克隆抗体的高分辨率cIEF从pH 4到10

近年来越来越多地采用了用于表征治疗蛋白的毛细管等电聚焦（疾病）分离。PI的测定增加了临界维度，以建立同一性，纯度，翻译后修饰和治疗蛋白质制剂的稳定性。在生物制药工业中进行的大量遗传分析涉及单克隆抗体（MAb）的表征。许多MAb在pH梯度的基本范围内具有PI的电荷同种型。

由于具有基本区域的含量的含量不足以及随时间的孔pH梯度的衰减，基本化合物在遗嘱中提供了挑战。向CIEF样品溶液添加阴极和阳极稳定剂有助于克服这些障碍。另外，优化稳定剂溶液体积，聚焦时间和两种方法能够开发在整个完整的pH范围内可以使用的单一方法。该策略使得能够开发用于产品管道表征的单个协议，也称为平台方法。

这一点很重要，因为生物制药行业需要简单和多功能性。这些努力的结果是，开发出了一种可靠的便携式分析技术，不容易发生操作错误或系统变化。

方法

单抗样品的制备

单抗样品的制备方法如下:

• 将500 μL的基本治疗性单抗(5- 10mg /mL)解冻并装入Microcon* Ultracell YM 10 (p/n A11530, Millipore, Billerica, MA)。
• 在12 k rcf条件下，在18号微生物培养液(p/n 367160, Beckman Coulter, Inc.， Fullerton, CA)中离心5分钟后，用20 mM Tris缓冲液替换过滤体积，pH 8.0。
• 完成两个额外的离心和缓冲液替换周期后，脱盐后的样品被同样引用为约50 μg馏分，并在-20℃或以下保存。

毛细血管和试剂

对毛细血管和试剂进行以下步骤：

• 在孔径为200 μm的毛细管筒中安装了50 μm的贝克曼Coulter中性毛细管(p/n 477441)。
• 安装前测量毛细管总长度为30.2 cm，从入口到检测窗的长度为20 cm，从出口到检测窗的长度为10 cm。
• 用39.5 mL的双去离子水(DDI)稀释550 mL 85% (w/v) (14.6 M)磷酸(Sigma 438081)，制备含有200 mM磷酸的阳极溶液为40 mL体积。
• 将12ml 1 M氢氧化钠(Sigma p/n 72082)稀释到28ml DDI水中，制备含有300mm氢氧化钠的阴极电解质溶液为40ml体积。
• 通过将0.8ml冰醋酸（99.8％），17.4M（Sigma P / N 537020）稀释至39ml DDI水，制备含有350mM乙酸的化学动员溶液。

表1。掌握制备混合。通过混合适当的组分体积，得到了一种cIEF主混合溶液。这些体积包括超过20%的体积，以考虑移液误差。主配药单份组成为Pharmalyte* 3-10 (GE Healthcare p/n 17-0456-01) 12 μL, 500 mM l -精氨酸20 μL, 200 mM IDA 2 μL, 1.25 mM肽pI标记物1.0 μL, 3m ureaciegel 200 μL。

试剂	单样品体积μL		3样品主混合体积μL
3M尿素 - 墓牙凝胶	200	x3.2	640
Pharmalyte 3-10载体两性电解质	12	x3.2	38.4
500mm精氨酸阴极稳定剂	20.	x3.2	64
200mm IDA阳极稳定剂	2	x3.2	6．4
合成肽pl 10标记物	1	x3.2	3．2
合成肽pl 7.0标记	1	x3.2	3．2

应用程序信息

获取毛细管清洗液的步骤如下:

• 将10.8 g尿素(Sigma p/n U0631)溶解在30ml DDI水中制成毛细管清洗溶液。
• 混合毛细管清洗液，直至固体全部溶解，然后通过5 μm孔(Pall p/n 4199)的Acrodisc* 25mm注射器过滤器过滤去除颗粒。欧洲杯猜球平台
• 3 M urea-cIEF凝胶的解决方案是由溶解尿素的1.80 g(σp / n U1250) 9毫升cIEF凝胶(p / n 477497),混合15分钟和加载到30毫升注射器(Becton迪金森p / n 309650)然后过滤使用5 -μM孔隙Acrodisc 25毫米注射器过滤器(4199年笼罩p / n)去除粒子。欧洲杯猜球平台
• 3 M尿素- cief凝胶溶液在2000 rcf下用Allegra X 15r离心机(Beckman Coulter p/n 392933)脱气，并在2-8℃保存。
• 阴极稳定器的解决方案包括500毫米Larginine是作为一个50毫升大部分首先溶解4.36 g精氨酸(98%)(σp / n A5006)固体35毫升的DDI水50毫升容量瓶,然后容量瓶动摇了15分钟溶解,最后增加体积和DDI 50毫升的水。
• 首先将1.33 g亚氨基二乙酸(98%)(西格玛p/n 220000)固体与35ml DDI水溶解在50ml容量瓶中，制成含有200mm亚氨基二乙酸(IDA)的阳极稳定剂溶液为50ml体积。
• 将混合物摇匀15分钟以溶解所有固体，用DDI水将体积增加到50 mL。
• 用6 mL DDI水稀释4 mL 50 mM Tris缓冲液(p/n 477427)，得到含有20 mM Tris的mAb缓冲液替代溶液。

表2。样品制备。混合完240 μL的主混合液后，将其加入含有整份脱盐单抗的试管中。将完整的样品溶液涡旋，200 μL转入PCR管中，滴入一滴矿物油(Sigma p/n 8410-5ML)，放入样品瓶中。

	10毫克/毫升马伯	5毫克/毫升马伯
掌握混合	240	240
脱盐马伯	5	10

仪器配置

仪器配置如下:

• 的Beckman Coulter PA 800蛋白表征系统配备紫外探测器和280 nm滤光片，带通+/- 10 nm。
• 检测器设置为以2hz的采集速率检测直接吸光度。
• 电子滤波器设置为正常设置，峰值宽度设置为16至25。
• 所有分离都在毛细管温度设置为20°C下进行。系统自动进样器设定温度为10°C。

调节方法

下面列出了以下的调节过程:

• 在毛细管初始安装后，中性毛细管通过将毛细管入口浸入含有1.8 mL DDI水的玻璃小瓶中进行水冲洗，并从入口侧施加50 psi的压力2分钟来调节。
• 延长的水冲洗之后是弱酸冲洗，将毛细管入口浸入含有1.8 mL化学活化剂的小瓶中，并从入口侧施加50 psi的压力2分钟。
• 最后，将毛细管入口浸入含有1.8 mL贝克曼库尔特cIEF凝胶的小瓶中，并从入口侧施加50 psi的压力5分钟，进行调理冲洗。

平台cIEF分离方法

平台cIEF

单抗样品采用以下分离方法分离:

• 首先清洗毛细管，将毛细管入口浸入含有1.8 mL毛细管清洗液的小瓶中，并从入口侧施加50 psi的压力3分钟。
• 在毛细管清洗溶液冲洗步骤之后，将毛细管入口浸入一个含有1.8 mL DDI水的小瓶中，并从入口侧施加50 psi的压力2分钟，用水冲洗毛细管。
• mAb CIEF样品溶液从毛细管进口侧施加25psi压力，持续99.9秒，进入毛细管。
• 在清洗、水冲洗和样品上样步骤中，将毛细管的出口端放入废瓶中。
• 进样后,被淹没梯度主要是毛细管的入口端进瓶含1.8毫升的阳极液和毛细管出口一侧的瓶含1.8毫升的阴极电解液和应用25 kV电势在毛细管,持续15分钟。
• 聚焦峰被化学动员，在此期间，用含有1.8 mL化学动员剂的小瓶取代阴极溶液，并在毛细管上施加30 kV电位20分钟。
• 移动步骤完成后，停止数据采集，将毛细管入口浸入一个含有1.8 mL DDI水的小瓶中，并从入口侧施加50 psi的压力2分钟，执行水冲洗步骤。

关闭方法

关机方法包括:

• 仪器关闭和毛细管存储在仪器上的最后工作日使用关闭方法,首先平衡淹没的毛细管入口毛细管的进瓶含1.8毫升的DDI水和50 psi的进口侧的压力申请2分钟。
• 水冲洗后，将毛细管入口浸入含有1.8 mL贝克曼Coulter cIEF凝胶的小瓶中，并从入口侧施加50 psi的压力10分钟，进行调节冲洗。

图1所示。初始条件。图片来源:贝克曼·库尔特

图2。探测器的设置。图片来源:贝克曼·库尔特

缓冲盘设置

在分离前，将装有1.6 mL cIEF分离试剂的玻璃瓶按图3所示的顺序放置在缓冲托盘中。毛细管清洗液的缩写是“Cap Clean Sol.”，化学动员剂的缩写是“Chem.”。暴徒。”箭头表示碱性pH梯度cIEF分离法增加的试剂和增加的方向。

图3。缓冲盘设置。图片来源:贝克曼·库尔特

结果

pH梯度范围和线性

两性电解质缓冲液的有效分离范围和线性度是影响两性电解质缓冲液pH值的重要因素。一组合成肽标志物的pI点在pH范围为4.1到10之间(表3)，使用基本pH范围方法进行了cIEF分离以评估线性。从这一分离(图4)可以看出，该方法具有较宽的功能范围，甚至在动员时间延长的情况下也能分离酸性肽标志物。

表3。pI标记检测时间。图4包含pI标记分离的点、氨基酸序列和检测时间。

π标记	氨基酸序列	动员时间最小值
10．0	H-Trp-Tyr-Lys-Lys-OH	22.408
9．5	H-Trp-Tyr-Tyr-Lys-Lys-OH	23.462
8.4	H-Trp-Glu-Tyr-Tyr-Lys-Lys-OH	27.375
7．0	H-Trp-Glu-His-Arg-OH	29.429
6．7	H-Trp-Glu-His-Arg-OH	29.892
5．5	H-Trp-Glu-His-OH	32.808.
4．1	H-Trp-Asp-Asp-Arg-OH	36.683

图4。合成肽pI标记物的cIEF分离。它包含了七个合成肽标记物的电泳图使用基本的pH梯度cIEF分离方法。动员步骤从35分钟延长到40分钟，以实现pI 4.1标记物的检测。图片来源:贝克曼·库尔特

合成肽标记的PI与检测时间（图5）的分析表明，梯度在pH10和4.1之间是线性的，其相关系数为0.99。高度基本的蛋白质物种未被正确聚焦有时被误认为是盐前沿。这在图4中示出为阴极预峰。

图5。pI标记线性模型。如表1中总结所概述的合成肽分离的PI值与检测时间的图。PI标记的动员拟合具有0.99的相关系数的线性模型，表明动员的pH梯度是高度线性的。图片来源:贝克曼·库尔特

三个单抗的分离

单抗在用cIEF分离时，往往会产生复杂的电荷同构体轮廓。这些配置文件加上实际的pI值为峰产生一个“mAb”指纹。正因为如此，cIEF可以成为单独单抗制剂鉴定和表征的强大工具。不同单克隆抗体的独特峰分布表明，使用广泛的pH 3到10两性电解质混合物的单一方法能够在梯度的基本范围内分辨pI的差异，最高可达1 pH单位的百分之几(图6)。

图6。三种基本单抗的cIEF分离。三种基本单克隆抗体的电泳图由cIEF使用相同的条件如图4所示。图片来源:贝克曼·库尔特

单抗分离的重复性

为了测试该方法的中间精密度，分别在6天内用两种不同批次的中性毛细管和试剂在两种仪器上分离3种抗体。所有数据均采用32karattm软件进行整合。利用pI 10和7合成肽标记物的检测次数，通过定性分析工具确定pI。对于每一个mAb，峰被分为三个亚型，碱性，主要和酸性，并计算每个亚型的百分比组成(图7-9)。记录了检测的三种单克隆抗体的7个特征峰的pI点和3个亚型组的百分比组成。然后用这些记录的值来计算变异系数(%CV)，这些变异系数用于测定重复性。

图7。(1)峰值图谱。单抗#1 cIEF分离的近距离观察。图片来源:贝克曼·库尔特

表4。MAB＃1遗传分离的定量分析。使用七个签名峰的PI点和三种同种型基团的百分比进行定量分析。

n = 25 计算P1.
山峰	平均	性病Dev	简历
一个	9.65	0.01	0.05%
B	9.58	0.01	0.06%
C	9.48	0.01	0.07%
D	9.44	0.01	0.09%
E	9.33	0.01	0.08%
F	9.27	0.01	0.07%
G	9.24	0.01	高达
异构体组百分比组成
集团	平均	性病Dev	简历
基本	13.94%	0.42%	3.04%
主要的	71.97%	0.46%	0.64%
酸性	14.09%	0.34%	2.38%

图8。mAb #2峰值概况。单抗#2 cIEF分离的近距离观察。图片来源:贝克曼·库尔特

表5所示。mAb #2的定量分析。采用与mAb #1相同的方法进行定量分析。

n = 25 计算P1.
山峰	平均	性病Dev	简历
一个	8.31	0．00	0.06%
B	8.18	0.01	0.07%
C	8.13	0.01	0.07%
D	8.07	0.01	0.07%
E	8.01	0.01	0.07%
F	7.90	0.01	0.07%
G	7.78	0．00	0.05%
异构体组百分比组成
集团	平均	性病Dev	简历
基本	30.97%	0.67%	2.17％
主要的	45.01%	0.45%	0.99%
酸性	24.02%	0.60%	2.50％

图9。单抗#3峰值概况。单抗#3 cIEF分离的近距离观察。图片来源:贝克曼·库尔特

表6所示。单抗#3的定量分析。采用与mAb #1相同的方法进行定量分析。

n = 25 计算P1.
山峰	平均	性病Dev	简历
一个	7.79	0．00	0.06%
B	7.59	0．00	0.05%
C	7.46	0．00	0.06%
D	7.43	0．00	0.04%
E	7.38	0．00	0.05%
F	7.28	0.01	0.07%
G	7.12	0．00	0.06%
异构体组百分比组成
集团	平均	性病Dev	简历
基本	18.03%	0.28%	1.53%
主要的	68.42%	0.42%	0.62%
酸性	13.55%	0.34%	2.49%

结论

一个单一的分离方法可以用于在一个很宽的pH范围内进行多个单克隆抗体的cIEF分析。使用单一的方法可以制备主分离混合物，这有助于减少移液误差和样品间的可变性。通过使用平台方法简化了工作流程，减少了操作人员出错的机会，提高了方法开发的整体效率。cIEF分离技术的分析能力通过在每一个单抗分离中产生的三个非常不同的峰谱来说明。该分离方法的重现性通过使用多种仪器和多种试剂在6天内进行一系列分离来验证。对pI和亚型组百分比组成的统计分析证实，即使在之前存在问题的pH梯度的基本区域，也可以实现单抗的高重现性cIEF分离。

该信息来源于Beckman Coulter, Inc. -粒子表征公司提供的材料，并经审查和改编。欧洲杯足球竞彩

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