自动数据收集和SERS

表面增强拉曼散射（SERS）作为分析技术越来越受欢迎。本应用笔记中讨论了使用自动收集和分析SERS以及使用DXR拉曼显微镜的多样本高通量分析的可能性。

为了说明两种不同的自动SERS采样方法，分析了两个样本，即：

• 包含microRNA的样品集，其在尺寸范围为21至25个核苷酸的小RNA分子
• 第二个样本集，包括在纸上的12个样品

自动化数据采集和管理

Thermo Scientific Amnic阵列自动化软件适用于自动收集和分析多个样本。

阵列自动化的显着特征是：

• 机动舞台的运动DXR拉曼显微镜或者通过软件控制DXR拉曼显微镜的孔板附件，并且舞台运动与样品的光谱数据收集协调。
• 该软件包括许多多样本平台的模板，如96孔板。
• 也可以使用该软件创建新的模板。
• 数据收集还包括几个选项
• 还提供了几种网格集合参数
• 对于不填充整个分析区域的不规则样本或样本，提出了两个选项，以获得最佳数据收集：软件使用定义的网格搜索最强信号，或者手动搜索样本并在收集之前侧重于每个样本位置

可用于阵列自动化分析的指标是：

• 基线上方的区域
• 峰面积
• 相关性
• 峰面积比
• 聚类分析
• 峰高
• 组分析
• 峰高比值
• 基线高度高度
• 主要成分
• 多变量曲线分辨率
• 定量结果

本应用笔记的主要焦点是使用阵列自动化来收集用于MicroRNA等多个SERS样本的大数据集。

实验

microRNA样本

实验程序如下所示：

• Meridian MicroRNA样品用于该项目的MicroRNA部分。
• 冻干样品达到反应管，并储存在-80°C直至所需
• 向反应瓶中加入不含rnase的水，形成样品溶液
• 摇动小瓶以确保整个样品溶解在水中。
• 最终溶液浓度为1μg/μl，不是所有样品具有相同量的microRNA。
• 将每种溶液分成几种等分试样，然后在-80℃冷冻直至所需的等分试样。
• 为了收集SERS光谱，使用具有780nm激光，亮田/暗场照明，20×显微镜物镜和电动显微镜级的DXR拉曼显微镜。
• 使用1 MW的激光功率分析样品。
• 激光功率控制是非常重要的，因为它可以确保样品在采集过程中不被激光损坏，CCD探测器不被信号饱和。用于制备DXR/SERS分析试剂盒，用于microRNA样品的制备。
• 2μl的microRNA水溶液与2μl的70 nm金胶体在微吸管的帮助下。
• 将两μl所得溶液沉积到金载玻片的12个斑点中的一个上。在数据收集之前，样品被风干。
• DXR SERS分析试剂盒的一部分，验证解决方案用于初步测试，以验证激光波长和金胶体粒度的组合提供有用的SERS响应。

图1．阵列自动化设置窗口显示12点光滑幻灯片的模板，已选择幻灯片左侧的6个点（A1-A3和B1-B3），用于多频谱网格集合

Omnic软件和阵列自动化软件用于数据收集和分析。下面列出的程序：

• 设计了12位金幻灯片的软件模板，并用于光谱分析。
• 对每个样品点采集一组光谱，使用Array Automation软件进行采集和运行。
• 图1显示了阵列自动化设置窗口的屏幕截图，显示为12点幻灯片的模板，为网格集合选择了6个点。从点到点使用50μm步骤，收集各侧的方形网格650μm。在幻灯片上每点生成169个光谱。

墨水分析样品

项目的墨水分析部分的程序如下：

• 收集12个不同的墨水源或笔和一支红色墨水，三个蓝色油墨和八个黑色油墨，用于制备样品。
• 创建纸模板与公司的12点显微镜载玻片的尺寸和尺寸相匹配。
• 只要在纸上写字，就可以在特定的点上沉积样品。
• 通过沿边缘镶嵌，将模板连接到显微镜滑块。
• 使用标准的柠檬酸液和Meisel方法，为SERS分析制备了一种银胶体溶液。
• 在一系列三种微透镜等分试样中，将总共12μl银胶体施加到每个墨点，在每个施加在每个施加以干燥之间设定的特定时间。制备并分析未处理的样品以进行比较。
• 借助DXR拉曼显微镜此次收集处理和未处理的样品的光谱，用532nm激光器10 x目的，明亮/暗场照明和电动显微镜阶段收集。2 MW激光功率与25μm狭窄孔一起使用。对于每个采样位置30，收集一秒扫描。
• 由于背景影响高，使用0.2兆瓦的激光功率，组合30扫描0.2秒
• 12-spot显微镜幻灯片模板在使用数组自动化,每样品13×13步网格点之间有一个50μm步取样位置,导致169光谱样品面积650 x 650μm,导致2000多光谱收集每个幻灯片

结果与讨论

微rna样本

图2显示了分析的三种微稻草样品的平均SERS光谱。在阵列自动化中，可以从网格显示或分析每个单独的频谱，或者软件可以收集样本点的所有光谱并在此处创建平均值，这里收集单个光谱。

图2.．所选MicroRNA样品的平均SERS光谱（使用荧光校正算法校正光谱）

图2显示了光谱之间存在大量相似性，但样品之间存在频谱差异。由于样品由类似的核苷酸制成，因此预期某些光谱相似性，但是核苷酸的布置是导致显着的光谱差异的原因。

图3显示了12点分析的结果，以及Array Automation如何显示所有数据点，以及基于分析算法的正方形颜色编码。一个样本集被指定为已知集，另一个样本集被指定为未知集。示例布局如图4所示。

图3.．阵列自动化频谱收集结果的示例，右侧显示的大电网是SPOT B3数据的扩展

图4.．显示MicroRNA样品的布局，左侧指定的样品在左侧，并指定为未知的样品位于右侧，斑点标有特定的MicroRNA样本数

使用标准的OMNIC软件创建了一个光谱库。然后将来自未知样本的光谱与已知样本库进行比对。图5显示了其中一个库搜索的结果。

图5.．MicroRNA库搜索结果B4的搜索结果，它被正确地识别为MicroRNA样本＃11（匹配％98.71）

首先，从库中检索到的光谱匹配率较高，其次，两个样本的光谱进行了可视化匹配。样品对样品的重现性对于任何好的分析方法都是非常重要的。

纸墨分析

墨水分析有两个目标，即：

• 使用来自油墨样品的光谱来证明SERS可用于在纸上的墨水分析。
• 开发一种鉴别所有墨水的方法，尤其是那些具有类似组成的诸如一个黑色墨水与另一个组成的方法。

图6显示了阵列自动化结果，用于在用银胶体处理的纸上分析12个墨水样品。还分析是一组未经处理的油墨样品。每个点在13 x 13栅格中包含169个光谱。对于SERS分析，可以平均偏离斑点或热点，以免歪斜结果。

图6.．阵列自动化结果为纸张SERS分析上的银色处理墨水

图7显示了未处理的油墨样品与SERS油墨样品的光谱平均值的比较。所有研究的墨水都显示出类似的响应，其荧光降低的双重机制和信号增强的结果。

图7.．拉曼的光谱比较纸上的黑色墨水的分析，以相同的强度刻度显示，以说明SERS的信号增强

图8显示了处理和未处理的红色墨水样品的平均光谱。SERS和常规拉曼墨水样本的光谱加载到TQ分析软件中。TQ分析师用于复杂的数据分析，尤其是大量数据。它可用于定量分析，定性分析和大型校准集。

用于10个油墨样品的数据用于化学计量分析。使用光谱构建定性判别分析方法。有效地比较SERS和常规拉曼数据，使用相同的参数用于两个数据集。

图8.．纸上红墨的拉曼和SERS光谱的光谱比较

图9示出了未处理的墨水样本数据的主要成分分数图，可以看出各种样品的清晰分离。使用相同的参数分析SERS光谱，并在图10中示出了所得到的主成分分数的图。

图9.．在纸张结果（拉曼）上未处理墨水的主成分分数图。1690中有750个错误分类的光谱，44.38％的光谱

图10.．主成分得分图为银处理油墨在纸上的结果(SERS)。1690中有54个错误分类的光谱，只有3.20％的光谱

自动化

任何类型的吞吐量分析的最关键因素都是自动化数据收集的能力。SERS数据收集仅限于需要分析师的单个样本，用于样品交换或分析同一样本的新区域。

从两个实验结果中观察到，源可以应用于不同类型的分析，借助于不同的SERS基材。阵列自动化使集合能够用于构建谱平均值的大量数据，用于统计模型或其他类型的数据分析。对于MicroRNA分析阵列自动化用于开发诊断方法，其中测试样品用于存在与疾病相关的特异性微小RNA，以及法医分析。该软件还可用于将墨水数据收集到伪造文档中使用的不同墨水的帮助中的帮助。

结论

通过集成自动数据收集DXR拉曼显微镜在OMNIC上添加了SERS衬底和阵列自动化软件，使SERS从单一样本分析方法转变为自动化的高通量分析技术，具有许多潜在的未来应用前景。在这篇笔记中显示的工作证明了用户能够准备每个载玻片最多12个样本，将载玻片放入仪器中，从每个样本中收集169个光谱，然后用各种工具分析这些数据。这一切都可以用一种仪器和一套软件工具来完成。

此信息已采购，从Thermo Fisher Scientific - 材料和结构分析提供的材料提供，调整和调整。欧洲杯足球竞彩

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