氯霉素是1949年首次使用的一种通用抗生素，作为人类的一线治疗药物，由于其潜在的有害相互作用和影响，如抑制骨髓，导致非再生性贫血或可能致死性特发性再生障碍性贫血等，氯霉素的使用受到限制。
此外，氯霉素是潜在的非竞争性微观组织酶抑制剂能够影响其他药物的代谢。它也用于兽医应用，但由于人类有害影响的可能性，而不是食物动物。
根据欧洲联盟决定2003/181 / EC，严格禁止牛奶中氯霉素存在的任何水平，所有氯霉素检测技术都必须满足或超越0.3 ppb的最小所需性能水平（MRPL）。一种液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)建立了一种运行在多反应监测(MRM)模式下的技术，用于用最少的样品制备检测牛奶基质中微量氯霉素的存在。该实验涉及使用三个MRM转换，其中两个用于确认，一个用于量化。氯霉素的定量限设为0.02 ppb，定量离子的比例一致。在0.02 ~ 1.0 ppb之间的标定曲线与R呈线性关系2= 0.9980(权重:1/X)。
实验
样品制备
实验使用剑桥同位素实验室的氯霉素-d5(100µg/mL in乙腈)和Sigma-Aldrich公司的氯霉素(98%)。空白乳基质的制备按Cronly等技术进行。将1 mL乙腈和0.5 g全脂牛奶在2 mL离心管中搅拌30 s，然后加入0.25 g NaCl摇晃30 s。以12000 rpm的速度离心10 min，将上层有机层移到离心管中，在45°C的Eppendorf真空浓缩器上蒸发干燥。提取液在0.5 mL初始流动相(90:10 Water:MeOH)中重组，然后用0.2µm PVDF注射器过滤器过滤。以0.3 ppb(基质中)d5-CAP为内标，在等量的乳基质中加入不同数量的CAP。
色谱法(推进高效液相色谱法)
- 色谱柱:ACE C18, 50x2.1mm, 3µ
- 流动相A:水
- 流动相B:甲醇
- 注射体积：10μL
- 流量:0.5毫升/分钟
- 梯度条件
- 0.00 min 10% B
- 0.05 min 10% B
- 2.50分钟95％b
- 3.00 min 95% B
- 3.10 min 10% B
- 4.50 min 10% B
质谱分析(EVOQ Qube)
- VIP加热ESI温度：400°C
- 锥气温度:350°C
- 加热探头气体:80单位
- 喷雾器气体:80个
- 锥气：10个单位
- 喷雾电压：-4500 V.
- 标准分辨率
- 活动排:
- MRM扫描时间:100ms/MRM
- CAP和d5-CAP MRM转换
- m/z 320.9>152 (CE:12v
- m/z 320.9>257 (CE: 8v)合格
- m/z 320.9>194 (CE:10v
- m/z 326>157 (CE:12v
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图1所示。Bruker Evoq.
结果和讨论
图2显示了最低峰值水平0.02 ppb(柱上200 fg) CAP和牛奶基质空白的重叠色谱图。在矩阵空白中检测到微弱的背景信号。另一方面，与最低峰值水平相比，矩阵干扰峰的强度非常低，可以检测到0.02 ppb的CAP。
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图2。在牛奶基体和基质空白中添加0.02 ppb的CAP叠加色谱图(TIC为3 MRMs)。
图3展示了CAP的所有三个MRMs的叠加色谱图，以及峰-峰(PP)信噪比(S/N)。对于0.020ppb CAP(柱上为200 fg)，基质中所有的信噪比(PP)均大于10。
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图3。牛奶基质空白(绿色)和添加在牛奶基质中的0.02 ppb CAP(红色)重叠MRM色谱图。
资格
第2002/657/EC号决议指出了验证所需化合物检测的各种参数。氯霉素是a类违禁物质，至少需要4个识别点(IP)。这可以通过至少2个MRM来满足，每个MRM产品离子分配1.5个IP，前体离子分配1.0个IP。在规定的公差下，每个MRM的离子比必须与认证的标准物质的离子比相匹配。对于离子比在最强烈转变的20%到50%之间的合格mrm，最佳允许公差为±25%。
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图4。MRM色谱图0.05ppb帽（柱上柱上的0.5pg），具有离子比率及其RSD（n = 3）
在该分析中，离子比值在0.05和1ppb水平之间是稳定的(<10% RSD)，如图4中0.05 ppb的例子所示。然而，如图3所示，由于基质对定量MRM(320.9>152)的贡献，0.02 ppb水平的离子比值超出了范围。然而，用基质空白校正后，离子比稳定在15%以内。
定量
图5显示了按0.020到1.0 ppb之间的校准曲线生成的6级矩阵，每级分析一式三份。R=0.9980(权重因子=1/X)时线性较好。
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图5。乳基质中盖帽（320.9> 152）的校准曲线从0.02ppb至1.0 ppb（6级：0.02,0.05,0.10,0.3,0.5,1.0 ppb）。
结论
建立了一种简单、快速的LCMS/ MS分析牛奶基质中痕量CAP的方法EVOQ qube三重四极杆质谱仪。EVOQ Qube可以检测和测量牛奶基质中0.02 ppb CAP的浓度。
这些信息已采购，审查和调整Bruker - Chemical and Applied Markets提供的材料。欧洲杯足球竞彩
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