豆类是主要的蛋白质供应者，特别是在发展中国家。因此，提高豆类种植效率将增加这些国家的粮食供应。
如图1所示，寄生在根瘤中的共生细菌对豆科植物的生长至关重要。
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图1所示。豆科植物（a）经常在其根部（b）中展示所谓的结节（b），其中根根亚细菌属于并生活在与植物的患者关系中。
根瘤菌与根细胞保持内共生关系。相关光和电子显微镜（CLEM）由于该技术利用荧光显微镜（FLM）和扫描电子显微镜（SEM）的优点，因此有助于更好地了解豆类宿主的感染和植入豆类宿主的定植。
FLM概述了细菌感染细胞的状态，而SEM图像揭示了这些细菌在细胞内的分布和亚簇关系。由于更高的分辨率，可以看到膜，因此可以看到那些细菌在膜包围的亚簇或共生体中的组织。
因此，利用CLEM可以在根瘤组织的背景下对不同的细胞进行统计分析。这使得CLEM成为系统生物学方法中收集相关数据的重要工具。
样品制备
样品制备是将绿豆植株的根瘤固定，接种慢生根瘤菌日本根瘤菌，高压冷冻，然后在液氮中储存，直到进一步处理。
然后freeze-substitution进行四氧化锇与2%醋酸铀酰丙酮和1% (28 h在-90°C, 8 h在-60°C和h在-35°C)。醋酸双氧铀和四氧化锇固定液保持超微结构和利用样品中脂质成分,同时担任重金属污渍改善扫描电镜对比。
用丙酮和乙醇洗涤后，用HM20（多电解）在乙醇中用HM20（多电解）浸润，用于嵌入，然后在新鲜纯HM20中聚合UV聚合。欧洲杯线上买球一旦树脂固化，将样品切成70nm超薄部分，利用配备有金刚石刀（Diatom族）的超微摩托。
然后将切片转移到涂有ITO的盖片上。然后用DAPI对切片进行染色，以便进行FLM成像。切片用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色后扫描电镜成像。
成像
将封面滑动放入Carl Zeiss为CLEM特别设计的样品支架中。在整个成像过程中，可以在LM和SEM中使用这个支架将样品牢固地固定在支架中。该持有人具有三个基准标记，以使非常快速和半自动校准班车和查找AxioVision软件的模块。
这些部分的FLM与来自Carl Zeiss的Axio Imager.m1，利用40倍物镜，例如EC计划 - 新扫描器40x / 0.75 M27和365nm励磁的过滤器组和445/50nm发射（过滤器组49）。从Carl Zeiss的Axiocam MRM配有显微镜，然后设定为成像1000 ms的曝光时间。在定义和选择荧光图像中的感兴趣区域（ROI）之后，将样品从Carl Zeiss转移到Gemini 1530 Fe-Sem。在完成半自动校准和随后的样品架的微量校准后，在FLM中成像的ROI立即以小于5μm的精度转移。然后，使用透镜中的二次电子检测器以2kV加速电压进行SEM成像。
结果
图2显示了根结节区域超薄切片的宽场FLM图像。细菌表现出DAPI荧光，细胞壁的荧光信号是由于自身荧光。因此，有可能识别特定的根细胞感染的细菌和分析细胞组装。
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图2。Mung Bean根结节的70 nm截面的FLM图像显示有和没有细菌感染的细胞;ROI由帧表示。
所选的ROI如图3所示。在共生体中可以清楚地观察到细菌的结构、胞内组织和方向。
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图3。FLM（A;放大）和SEM（B）图中选择的ROI图像。可以清楚地识别细菌群（P），细胞核（N）和真空（V）。
此外，可以在FLM和SEM图像的比较中精确地分配其他细胞化合物。另外，SEM图像的高信噪比使得特定结构的分割，因此允许半自动地收集统计数据。
结论
的班车和查找克隆的界面促进了豆类根瘤细胞的细菌感染分析快速且可靠地。由于在两个显微镜系统中识别相同的ROI的过程，该界面显着加速了工作流程。因此，可以在合理的时间内执行串行部分成像，从而能够改变生物系统的3D组织。此外，该解决方案为新的可能性铺平了新的可能性，特别是对于微观图像中的统计数据分析，现在可以系统地进行。
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