鸣禽脑的相关光镜和电子显微镜分析

鸣禽向导师学习鸣叫，就像人类学习语言一样。由于这种相似性，鸣禽被用作动物模型来探索与这种复杂行为相关的大脑区域和网络。

因此，了解鸣禽大脑的学习过程将有助于更好地理解人类的语言学习和言语。

如图1所示，鸣禽大脑中的几个区域参与了鸣声的学习和产生。大脑中有几个区域与HVC区相连，HVC区是发声的主要前运动区。

图1所示。鸣禽大脑中与歌曲学习和产生有关的区域的示意图。注射是在X区进行的。

本文讨论了在超微结构水平上对HVC内部连接的分析。通过用示踪剂标记投射到大脑“X区”的细胞，就有可能分析它们在HVC中的连通性。

相关光电子显微镜(CLEM)因为通过荧光显微镜(FLM)和扫描电子显微镜(SEM)识别HVC区域细胞的投影是很重要的，而通过扫描电子显微镜(SEM)识别细胞的超微结构也是很重要的。

样品制备

用立体定位坐标追踪斑胸草雀大脑X区，并接种0.5µl Alexa 488右旋糖酐。5 d后，用2%多聚甲醛0.075%戊二醛溶液在0.1 M磷酸盐缓冲液(pH 7,4)中灌注，然后切成60µM厚度的矢状切片。

洗后甲次砷酸盐缓冲(4)pH值0.1米,7日,亚铁氰化钾和后缀在1.5%,1%四氧化锇和1%四氧化锇了40分钟,终于postfixed的部分在1%醋酸双氧铀在蒸馏水40分钟。部分被脱水和嵌入Durcupan ACM树脂,52℃固化48 h。

切除HVC周围区域，固定在空白树脂块上，切成60- 90nm厚度的超薄切片。切片转移到ITO涂层的盖片上，然后用雷诺柠檬酸铅染色2分钟，用ddH清洗₂连续三次，持续30秒。

成像

将封面滑动放入Carl Zeiss为CLEM特别设计的样品支架中。在整个成像过程中，可以在LM和SEM中使用这个支架将样品牢固地固定在支架中。该支架具有三个基准标记，使AxioVision软件的Shuttle & Find模块能够非常快速和半自动校准。

利用Axio成像仪对截面进行FLM。来自Carl Zeiss的ZI，利用100倍物镜(EC Epiplan-Neofluar 100x/0.90 HD DIC)和470/40 nm激发和525/50 nm发射的滤光片(滤光片组38HE)。然后显微镜上安装了卡尔蔡司的AxioCam MRm。在确定和选择荧光图像中的感兴趣区域(ROIs)后，将样品移到卡尔蔡司的SUPRA 40VP扫描电镜上。然后对支架进行半自动校准以定位FLM中的帧图像，然后对所选roi进行精细校准，使其精度低于5µm。利用透镜内二次电子探测器在1.5 kV加速电压下进行扫描电镜成像。

结果

HVC区域超薄切片的宽视场FLM图像如图2所示。荧光点代表示踪剂所在的细胞室，从而识别并选择从HVC到Area X的神经元作为ROI。

图2。具有突出感兴趣区域的超薄切片的FLM图像。

图3进一步演示了所选的ROI。

图3。图2中选择的ROI处的FLM (3a)和SEM (3b)图像。

图2放大切片如图3a所示，所选神经元结构的SEM成像如图3b所示。图4显示了所选ROI的FLM和SEM图像的叠加，证实了两个显微镜系统实际上成像的ROI是相同的。

图4。图2中选择的ROI覆盖。

左上部分被选中的神经元在更高的放大倍数下显示在图5的FLM和SEM覆盖层中。

图5。图4中的放大倍率叠加;扫描电镜图像清晰地显示了线粒体(A)、有髓轴突(B)或突触囊泡(C)的结构。

结论

快速可靠的高分辨率背景成像的特定连接神经元是可能的航天飞机和Find接口CLEM．用荧光示踪剂标记后，用FLM和SEM对神经元进行成像。

这两种信息叠加后，可以根据LM数据对SEM分析的神经元进行分类，而同一切片的SEM成像则呈现了超微结构信息。

虽然本文只演示了一种荧光颜色，但通过对不同类型的神经元使用不同的颜色，可以将该方法扩展到多色跟踪和成像来表征网络。

这些信息来源于卡尔蔡司显微技术有限公司提供的材料。欧洲杯足球竞彩

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