Optilab UT-REX差分折射仪技术，用于超高效液相色谱法

分析高效液相色谱法（HPLC）被广泛用于分析化学领域识别和量化样品中存在的分子种类。的概念和超高性能液相色谱法的应用（UHPLC）类似于HPLC，但具有较小的珠子，并与HPLC柱。理解为一上线UHPLC DRI检测的要求，悦科技推出的Optilab UT-REX在2013年2月。

除了更高的数据速率之外，UHPLC的要求符合UHPLC的窄峰宽度质量，uhplc的要求弥补了UHPLC的要求。

另外，UT-REX包括相同的光电二极管阵列技术和温度调节为T-REX。本文介绍几个基本的UHPLC由UT-REX DRI检测手段分析。

蛋白片段或杂质

牛血清白蛋白（BSA），用于校准蛋白质定量和浓度测量的典型试剂，通常含有97-98％的单体含量和一定量的蛋白质材料，其中大部分是BSA的不可逆聚集体，如调光器和三聚体．

使用UHPLC的高分辨率分离在Sigma-Aldrich BSA中提供了一种新的特征，比主要单体晚在的小峰，如图1所示。

新的峰值是同时在UV和UT-REX DRI色谱痕迹可见。然而，这是不可能通过单独UV或RI检测手段的任何的小峰的潜在来源之间进行区分。

然而，新峰的UV：RI比率是60-70％大于所述单体的，这意味着新的物种包含比单体更UV-活性材料。这反过来，表明新品种不能是错误折叠的BSA或聚合，但必须是一个杂质或片段。

图1。甲少量杂质或片段在BSA检测通过UHPLC与300mm的尺寸排阻柱和UV + UT-REX RI。不同的UV：相对于单体和二聚体的片段的RI比率指示不同的初级组合物。

异构体

除非异构体在形状上有很大差异，否则可能无法通过标准的高效液相色谱尺寸排除色谱(SEC)或使用短柱(150毫米)的UHPLC SEC来区分异构体。另一方面，安装一个长柱(300毫米)显著提高了UHPLC分离，从而能够分辨出明显不同的异构体，如图2所示。

图2。IgG、UV + UT-rEX RI的UHPLC-SEC色谱分析。顶部：短，150 mm列显示单体和二聚体，但没有更多。顶部:短，150毫米柱显示单体和二聚体，仅此而已。底:长，300毫米柱解决附加种。常见的UV:RI比值表明所有物种的一级序列大致相同，因此新的峰可能是单体和二聚体的同分异构体。

如图2所示，分化的峰是在单体和二聚体两者的后缘可见。当与UV的比率：RI，以确定这些物质的组合物中，所有的峰显示出相同的UV：RI比率，表明一对是单体的异构体和另一对是二聚体异构体。

通用检测和校准栏

当与其它检测技术，折射率检测是相对通用的，几乎普遍的，只要是利用等度方法。峰面积相结合，以确定所述检测器响应。DRI可以处理许多不同的样品，包括油，合成聚合物，小分子药物化合物，脂质，寡核苷酸，碳水化合物和蛋白质。

借助于UT-REX和反相UHPLC柱的组合分离糖的分离图3.用UT-rex的UHPLC尺寸排除柱的校准在图4中描绘，在整个摩尔质量范围内显示出良好的校准线性。

图3。在UHPLC柱上的糖分离，由UT-rex检测到。

图4。UT-REX用蛋白质标准校准柱子。校准曲线是高度线性的。

峰面积线性

测试线性度的一种标准方法是注入由各种总质量组成的等量链，按干重测量。结合峰值区域来识别探测器的响应。

图5示出了由UT-REX反对注入质量确定的峰面积的未结线性响应的绘图。这种线性在±4.7×10-3 rIU的整个动态范围内是一致的，其对应于〜35mg / ml碳水化合物或25mg / ml蛋白质。这确保了通过任何分析色谱法，探测器响应不会饱和，以便在包括最准备的色谱法中分离。

图5。UT-REX的线性定量响应。探测器在非常宽的范围内线性，最高可达约25mg / ml蛋白质。

紫外 - 无活性杂质检测

分析UHPLC-SEC积分的UV检测器通常用于紫外活性物质的质量控制，例如蛋白质。然而，样品中的污染物可能并不总是具有发色团，并最终将通过被忽视。在这种情况下，掺假样品将清除QC测试。

三种蛋白样品:纯IgG(红色)和被两种代表性杂质(10 kDa右旋糖酐(蓝色)和40 kDa右旋糖酐(绿色)污染的IgG样品的联合UV-RI分析如图6所示。图6a显示了覆盖的UV轨迹，图6b显示了覆盖的RI轨迹。通过两幅图的比较，说明了如何通过双重检测将杂质与蛋白质区分开来。

图6。在蛋白质分析中发现杂质。流动相为磷酸盐缓冲盐水。绿色:纯免疫球蛋白;蓝色:IgG + 10kda右旋糖酐;试剂:IgG + 40 kDa右旋糖酐。上图:紫外检测。下:UT-rEX探测dRI。

样品的溶剂梯度检测

溶剂梯度通常与流动相的折射率的剧烈变化有关，压倒性和饱和大部分在线差分折射率检测器。

UT-rex也有益于Optilab T-rex的相同扩展动态范围，使其能够适应这些大变化，同时保持灵敏度，即使溶剂梯度允许小样本峰值检测。

图7展示了梯度色谱与dRI检测，利用Optilab rEX技术在标准HPLC系统上的扩展范围。虽然折射率在整个色谱中变化很大，UT-rEX dRI检测能够清楚地捕捉洗脱溶菌酶峰，并从初级物种中分辨出变体或杂质。

图7。分析反相乙腈/水梯度，10％→90％，由DRI的。样品是溶菌酶。上：用溶菌酶的250微克注射出现作为在一个急剧变化RI信号小特征的原始数据。底部：基线减法，此时距离溶菌酶的25微克注射（其是针对梯度基线几乎不可见）之后。早期洗脱，小峰不明。

结论

Optilab UT-REX是通用检测器，使独立操作能够作为UHPLC柱下游的鞋底在线检测器，或者可以与另一种检测器一起使用，例如UV / VIS吸收。上述基础UHPLC清楚地证明了这一创新探测器的能力。

UT-rEX与任何供应商的UHPLC系统兼容，尤其适用于脆弱的生物分子，因为它允许在实验室标准室温下的温度低于环境温度4°C。在任何使用超高效液相色谱技术的分析实验室中，它都是一个有价值的工具。

此信息已经来源，审议通过悦科技提供的材料改编。欧洲杯足球竞彩

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