使用CG-MALS在多价抗原和双价结合伙伴的异联中形成元复合物

在标准的大分子相互作用分析方法中，如SPR和ELISA，需要结合伙伴，以固定在表面上，以定量结合亲和力。平衡解离常数(K_D对于简单的1:1关联以及一些1:n的相互作用而言，这种物理拴系对被测量对象的影响不大。

然而，如果两种结合伴侣是多价的，则固定一个配体可以通过大规模运输限制，表面的可亲和力效应和围绕相互作用的化学计量的假设来导致倍数的错误测量。

然而，成分梯度多角度光散射(CG-MALS)完全在溶液中进行相互作用测量，使预期的结合化学计量学得以发生，并促进了对间复合物形成、自和异质相互作用以及其他多价相互作用的量化。

本文讨论了抗链霉亲和素抗体(Ab)与同型四聚体链霉亲和素(SA)结合后的复杂化学计量学分析。

试剂和仪器

CG-MALS实验过程包括将链霉亲和素(Sigma-Aldrich)和抗链霉亲和素抗体(Amgen)稀释到10µg/mL的浓度，置于磷酸盐缓冲盐水(PBS;25毫米不₂阿宝₄， 25mm Na₂HPO₄， 50 mM NaCl, 200 ppm NaN_3.pH 6.7)，每个蛋白每次实验共100µg。然后使用antop注射器过滤器(Whatman)将每个溶液过滤到0.02µm。

然后将得到的溶液输入Wyatt Technology的Calypso II组合梯度系统。该系统制备并提供各种蛋白质组成，并配备Wyatt DAWN HELEOS MALS检测器和内联UV/Vis检测器(Waters)，如图1所示。

在Calypso上安装0.1µm孔径的聚碳酸酯(微孔)过滤膜，用于样品和缓冲过滤。采用Calypso软件进行数据采集和平衡关联常数分析。

图1所示。Calypso系统硬件设置与内联紫外/浓度探测器和黎明Heleos MALS检测器。

结果

异质关联梯度区域中的增加的光散射信号表现出Sa和Ab与高于简单1：1或2：1化学计量的分子量的复合物中的复合物，如图2所示。自自我关联以来这些蛋白质不可能在这些条件下，两个结合伴侣的多价性质必须是高阶化学素的原因。

图2。SA和Ab相互作用的光散射和浓度数据。这种关联大于1:2相互作用(黑点红线)。

在“交叉”异质关联梯度中，具有最佳光散射信号(重量平均摩尔质量，M_w)按相互作用的总化学计量比发生。这个比例加上M的大小_w生成相互作用的绝对化学计量数。测量值M_w到三个简单的SA:Ab化学计量图如图3所示。

图3。测量米_w与模拟M相比_w每个结合位点KD = 0.2 nM的指示化学计量学。

峰值在m中的位置_w测量表明，与n:2n(紫色实线)或2n:n(绿色虚线)相比，最大的配合物形成的化学计量比为n:n(红线虚线)。对于每个模型，每个结合位点的亲和力被认为是恒定的(KD = 0.2 nM)。

虽然测量数据在1：1摩尔比附近实现最佳值，但最大测量的m_w与1：1模型（〜200kDa）的最大分子量相比（〜350kDa）相当大。

考虑到每种SA分子的两个AB的模拟达到了正确的最大MW（〜330kDa;图3，实心紫线）。然而，与测量数据相比，这种最佳值在错误的组合物中进行。该模拟模型大大低估了测量的MW，了解含有过量SA的所有组合物。

综上所述，这些数据表明存在总化学计量比为1:1的高阶配合物，即(SA)。₂(Ab)₂(SA)_3.(Ab)_3.等。这可能是一个令人惊讶的结果，因为与Ab上的两个结合位点相比，这四个可能的结合位点SA表明复合物可以以更高的SA:Ab比率发生，如图4所示。

图4。定量链霉亲和素与抗链霉亲和素抗体之间相互作用的组合梯度方法。

饱和大多数结合位点的复合物可能具有2(SA):1(Ab)的总化学计量比。考虑了两种不同的模型来表征SA-Ab相互作用:[(SA)(Ab)]碱基的无限自缔合成n:n配合物，以及更精细的分析，除了n:n配合物外，还包括n+1:n和n:n+1配合物。

第一次通过分析：无限的自我关联（ISA）为1：1 stoichiometries [（Sa）（ab）]_n

根据该模型，AB用亲和力Kd = 22nm结合SA，[（Sa）（ab）]基本单元用Kd = 50nm自组装。代表两种抗体结合链霉抗生物素蛋白分子（SA）（AB）的额外术语₂需要完全捕捉光散射的变化作为组成的函数。显著浓度[(SA)(Ab)]_n如图5所示，在这些条件下，n>3络合物是不可用的。

图5。采用ISA模型对CG-MALS异质关联数据进行最佳拟合。上图:测量光散射数据(蓝色填充圆)的最佳拟合(红色未填充圆)包括来自(SA)(Ab)、(SA)(Ab)的贡献。₂， ISA种。紫色的正方形给出了所有物种对模型的总体贡献与化学计量[(SA) (Ab)]_n与n > 1。下:对于每种组成，可以计算出物质在溶液中的摩尔分布。在这两个图中，为了清晰起见，SA和Ab单体的贡献都被省略了。

精致分析：列入所有（SA）_我（ab）j，对于i，j <3

ISA模型表明，如果SA分子已经与另一个Ab分子相连，Ab与SA结合的亲和力就会降低。空间位阻可以解释这种低亲和力的复合物形成。更全面的分析包括n+1:n和n:n+l配合物以及n:n配合物。

在本分析中，(SA)(Ab)₂(SA)₂(Ab)和(SA)_3.(Ab)₂对于总光散射具有显着的贡献，如图6所示。其他化学物质，包括（SA）₂(Ab)_3.和(SA)₂(Ab)₄，退出适合有任何贡献的整体光散射信号。这说明，相对于SA与Ab的结合位点，更倾向于SA与Ab的结合位点饱和。

图6。假设任意（SA）的CG-MALS异质关联数据的最佳拟合_我(Ab)_j化学素质。左：最佳拟合（红色未填充圆圈）到测量的光散射数据（蓝填充圆圈）由所指示的化学物质测量仪的组合组成。右：跨异性关联梯度分布物种。n> 3包括所有的stoichiometries [（sa）（ab）]_nn > 3。在这两个图中，为了清晰起见，SA和Ab单体的贡献都被省略了。

该分析结果k_D值的窄范围为每个结合位点23±4 nM。每个结合位点的恒定亲和力表明了ISA模型假设的影响元复合物形成的负协同性的缺失。此外，与ISA模型相比，这个改进模型的残差更小，更随机，如图7所示。

图7。第二个，“精细化”模型(蓝钻)的残差比第一个，“仅ISA”模型(红色方块)的残差更小，更随机，表明更好的拟合数据。

结论

结果表明，CG-MALS能够分析溶液中多价结合伙伴形成的元复合物，从而获得结合亲和力和绝对化学计量学数据。通过这种分析，CG-MALS证明了其研究溶液中复杂的大分子体系的能力。

这些信息已经从Wyatt Technology提供的材料中获得、审查和改编。欧洲杯足球竞彩

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