了解通过分子量测量的医学处理抗体

治疗性重组抗体主要是免疫球蛋白G同种型（IgG），占生物药物的不断增长的份额，并且在市场上可获得越来越多的批准的抗体治疗，以治疗糖尿病，类风湿性关节炎和癌症等疾病。

此外，更多的候选igg正在生物制药的开发过程中。因此，获得更多关于这些候选者的知识对成功开发非常重要。免疫球蛋白的分子结构如图1所示。

图1所示。免疫球蛋白的分子结构。

仪表

然而，生物制药行业面临的一个关键问题是蛋白质聚集的形式。随着时间的推移，蛋白质有聚集的趋势，因为它们只有有限的保质期。血液中的蛋白质聚集物可以定期促进主动/适应性免疫反应。尺寸排阻色谱(SEC)是一种用于评价蛋白质配方聚集含量的可靠技术，通过大小分离蛋白质，测量其分子量并确定样品中的聚集比例。

当SEC与光散射检测器耦合时，可以直接测量蛋白质的分子量。此外，不管保留体积如何，该设置能够分化单体，二聚体和聚集体。如果使用的光散射检测器是多角度光散射（MAL），则可以测量环形的循环（RG），用于各向异性地散射光的大聚集体，从而提供有关结构和形状的更多信息。

图2。vistik SEC-MALS 20仪器。

图2所示的仪器之一是vistik SEC-MALS 20系统，这是一种20角光散射装置，可以测量蛋白质和蛋白质聚集物的分子量，而不受洗脱体积的影响。本文讨论了用SEC方法分离纯化的多克隆抗体(IgG)，然后利用vistek SEC- mals 20进行后续表征。

实验程序

使用TDA RI检测器，SEC-MALS 20检测器连接到visittek的TDAmax系统进行浓度测量。样品沿2个维世泰克蛋白柱分离。以磷酸盐缓冲盐水为流动相，制备IgG样品。检测器和色谱柱保持在30°C，以实现良好的分离并优化基线稳定性。

实验结果

图3。IgG的色谱图显示折射率(红色)和MALS(90°)检测器信号。MALS测量的分子量用黑色覆盖。

图4。MALS探测器的覆盖物响应IgG。

成功表征的IgG样品使用Viscotek Sec-MALS 20如图3所示。不同MALS角度的数据如图3所示。图4显示了来自不同MALS角度的数据。计算得到的分子量如表1所示:

表1．测定IgG样品中不同峰的分子量。

	聚合	倍数	单体
峰值RV - (ml)	13.23	14.00	15.80
(Mn) - kDa	674.12	308.6	147.2
(Mw) - kDa	7661.00	309.2	147.4
Mw /锰	11.364	1.002	1.001
Rg (w) - (nm)	26.6	N / C	N / C
wt fr（山顶）	0.014	0.065	0.921

结果表明，分析的样品实际上是相当复杂的，并被分离成三个峰。原峰的测量分子量为147 kDa，与IgG的分子量非常接近，说明该样品为IgG单体。

二次峰显示出在300kDa的测量分子量，表明样品是二聚体。此外，分子量在这两种峰之间非常稳定，揭示它们是单分散的并且具有明确定义的分子量和结构。

第三个峰略有不同，光散射信号远大于折射率信号，相应的分子量较高。分子量变化很大，从大约600 kDa到7x104 kDa不等。从多分散性值(Mw/Mn)可以看出，第三个峰是非常多分散性的，这意味着它的分子量范围非常广，表明它是非特异性聚集。因此，这些聚集物中的任何IgG分子都可能失去大部分或全部活性。

浓度检测器能够对单个种群进行量化。这些个体人口的比例也列于表1。单体峰占样本量的92%，二聚体峰只占样本量的7%，大聚集体峰占样本量的2%以下。

按照SEC和MALS的标准，蛋白质是相对微小的分子。由于可溶性蛋白是各向同性的散射体，其半径通常小于10 nm，因此无法使用MALS测量其Rg。这对这里分析的IgG单体和二聚体形式是正确的。然而，一些最大的团聚体的Rg值是可以测量的，因为它们有足够的尺寸作为各向异性散射体。

在分析图4时，可以在聚集峰的散射中看到一些角度依赖性，从而提供26.6nm的平均RG。从聚集峰顶部获得的相应的ZimM图如图5所示。从图6中所示的单体峰的顶部取出的ZimM图表明IgG单体是各向同性散射体。

图5。Zimm图显示总峰的各向异性散射。

图6。Zimm图显示了单体峰的各向同性散射。

结论

结果清楚地表明，对于大到足以证明各向异性散射的分子，vistik SEC-MALS系统能够测量蛋白质的分子量，而不受其结构和洗脱体积的影响，以及Rg形式的分子大小。

的SEC-MALS 20是任何SEC系统的理想额外探测器，提供一种具有高质量MAL能力的工具，可直接测量蛋白质分子量。

这些信息已经从Malvern Panalytical提供的材料中获得，审查和改编。欧洲杯足球竞彩

有关此来源的更多信息，请访问莫尔文Panalytical．