蛋白质易于影响聚集，这被认为是生物制药行业的一个主要问题。这是因为聚集体的存在将激活免疫反应 - 生物药物的风险因素。
仪表
尺寸排斥色谱(SEC)是一种广泛应用于蛋白质聚集研究的可靠技术。SEC工具和光散射的结合，可以进行蛋白质的分子量测量，而不管它们的保留体积。这反过来又有助于理解蛋白质样品的行为，通过允许测量样品中存在的单体、低聚物和聚集体的分子量。
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图1所示。Viscotek Sec-MALS 20系统。
多角度光散射(MALS)的使用使得测量分子的旋转半径(Rg)显示各向异性散射。如图1所示的一个这样的工具是粘泰克SEC-MALS 20系统，一种20角光散射装置，可以测量蛋白质和蛋白质聚集体的分子量，而不管洗脱体积。添加更多的检测器，包括动态光散射（DLS），本征粘度（IV）和浓度检测器（RI，UV）可以帮助从单秒测量中获取更多数据。
本文讨论了使用SEC和随后的SEC-MALS分析来分离所选蛋白质，以测量其低聚物和聚集体的分子量。
实验程序
TDA RI检测器用于将SEC-MALS 20系统连接到visittek的TDAmax系统进行浓度测量。样品沿2个维世泰克蛋白柱分离。以磷酸盐缓冲盐水为流动相，将样品全部溶解。
牛血清白蛋白，具有良好的分子量的蛋白质，用于校准SEC-MALS系统。探测器和柱保持在30°C以实现良好的分离并优化基线稳定性。
实验结果
BSA样品通常含有单体，低聚物和较大的聚集体。单体，二聚体和三聚体的峰是清晰可见的，MALS用于精确测量其分子量。样品中也存在一定量的多分散高阶胚。这些聚合不能单独解决。BSA色谱图如图2所示，表1中列出了BSA测量结果。
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图2。BSA的色谱图显示折射率（红色）和SEC-MALS（90°）检测器信号。SEC-MALS测量的分子量用黑色覆盖。
表1．牛血清白蛋白样品不同组分的分子量。
|
聚合 |
三者 |
倍二 |
单体 |
| 峰值RV - (ml) |
13.84 |
14.31 |
15.37 |
17.05 |
| Mn - （KDA） |
337.3. |
199.4 |
133.6 |
66.1 |
| (Mw) - kDa |
378.3 |
201.2 |
133.9 |
66.3 |
| Mw /锰 |
1.122 |
1.009 |
1.003 |
1.002 |
| Rg (w) - (nm) |
N / C |
N / C |
N / C |
N / C |
| wt fr（山顶） |
０．０４ |
0.057 |
0.423 |
0.745 |
单体、二聚体和三聚体各峰的分子量高度稳定，表明它们是单分散的。如果分子量稳定，那么它们就是低聚物。在由更分散的群体组成的最早的洗脱材料中，分子量痕迹是高度可变的。这是不太可能有活性的变性聚集体的特征。在“Wt Fr”行中确定了每个峰中总样本的比例。
第二种蛋白为甲状腺球蛋白，其色谱图如图3所示。从不同角度获得的MALS信号可以在MALS图中观察(图4)，测量结果如表2所示。
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图3。甲状腺球蛋白色谱图显示折射率(红色)和SEC-MALS(90°)检测器信号(橙色)。SEC-MALS测量的分子量用黑色覆盖。
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图4。SEC-MALS甲状腺球蛋白检测信号的色谱分析。
表2.．测量甲状腺素样品的不同峰的分子量。
|
聚合 |
单体 |
| 峰值RV - (ml) |
11.60 |
12.50 |
| Mn - （KDA） |
1601.0 |
681.5 |
| (Mw) - kDa |
2588.0 |
686.0 |
| Mw /锰 |
1.617 |
1.007 |
| Rg (w) - (nm) |
N / C |
N / C |
| wt fr（山顶） |
0.167 |
0.833 |
根据RI检测器，将甲状腺环蛋白样品分成两个峰，但SEC-MALS检测器检测三个峰。通过SEC-MALS检测器识别出痕量的非常大的聚集体，但是RI检测器只能看到它们。单体分子量为686kDa，其在甲状腺球蛋白的3％范围内669kDa。单体峰的稳定性表明该群体是单分散的。
聚集体峰，分析作为一个单一的组成，表现出更高和更可变的分子量(多分散)，表明它们是无序聚集体。这些总数约占样本的17%。虽然蛋白质具有较高的分子量，但SEC-MALS能够揭示从单体和聚集物的散射是各向同性的。因此，不可能确定这个样品中任何一个峰的Rg。
Pepsin是分析的最终样品，其色谱图如图5所示。在MALS图中可以观察到从不同角度获得的SEC-MALS信号（图6），并且测量结果列于表3中。
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图5。胃蛋白酶色谱图显示折射率(红色)和SEC-MALS(90°)检测器信号(橙色)。SEC-MALS测量的分子量用黑色覆盖。
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图6。胃蛋白酶SEC-MALS检测器信号的色谱分析。
表3．测定胃蛋白酶样品不同峰的分子量。
|
聚合 |
单体 |
降解产品 |
| 峰值RV - (ml) |
10.84 |
18.33 |
20.92 |
| Mn - （KDA） |
3892.0 |
34.4 |
4.7 |
| (Mw) - kDa |
4431.0 |
34.7 |
6．4 |
| Mw /锰 |
1.138 |
1.008 |
1.364 |
| Rg (w) - (nm) |
69.9 |
N / C |
N / C |
| wt fr（山顶） |
0.008 |
0.569 |
0.423 |
胃蛋白酶样品被分为两个主峰，其中第二大峰测得的分子量为34.7 kDa，与胃蛋白酶已知的分子量35 kDa非常接近。较大的峰的分子量要高得多，变化更大，清楚地表明它有一些无序的聚集物，可能不再有功能。
虽然它是一个如此大的光散射峰，聚集物代表不到1%的总材料在样品中。根据MALS图，这些聚集物是强各向异性散射体，因此可以测量它们的Rg。表中显示的实测Rg值约为70 nm。
胃蛋白酶有农石结构，这意味着它比通常对具有分子量的蛋白质的蛋白质大致预期。聚合大小说明了结构实际上持续在聚合中，在它们变得非常大之前。对于RG测量，胃蛋白酶单体不够大。尽管样品中的第三峰没有明确定义，但其分子量可以测量（大约6kDa）。
结论
结果清楚地证明了维粘tek SEC-MALS 20系统的能力，以提供各种蛋白质的分子量和团聚含量的测量。
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这些信息已经从Malvern Panalytical提供的材料中获得，审查和改编。欧洲杯足球竞彩
有关此来源的更多信息，请访问莫尔文Panalytical．